副豬嗜血桿菌分子流行病學調查及其HSP70對PRRSV結構蛋白GP3-GP5的免疫協(xié)同作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， H.parasuis）是豬Glasser's病的病原體，豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。目前，我國很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血桿菌，該菌已成為保育豬死亡的主要原因之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。但由于不同血清型及同一血清型的不同菌株之間抗原性差異較大，交叉保護性差；同時該菌的毒力因子

2、和保護性抗原尚不清楚，因此，目前尚無有效的預防和控制措施。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，又稱“豬藍耳病”，本病以妊娠母豬的繁殖障礙（后期流產、死胎、木乃伊胎、弱胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾?。ㄩg質性肺炎）為特征。本病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失，現已成為

3、危害規(guī)?；B(yǎng)豬生產的主要疫病之一。目前，已有商品化的弱毒疫苗和滅活苗用于PRRS的防制，但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保護。近年來，我國大范圍出現高致病性PRRSV感染，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失，同時也對該病的防治帶來新的挑戰(zhàn)。
　　 本研究對我國6個省市的副豬嗜血桿菌的分子流行病學進行了調查，對其熱休克蛋白70(Heat shock protein70, HSP70)進行了克隆鑒定，并設計構建了共表達副豬嗜血桿菌H

4、SP70或其羧基端與PRRSV膜相關蛋白GP3和GP5的重組腺病毒，通過小鼠免疫試驗證明了副豬嗜血桿菌HSP70及其羧基端的免疫增強作用，并通過攻毒保護試驗證實了對高致病性毒株攻毒有一定的免疫保護效果，為PRRSv基因工程疫苗研究提供了新的思路。
　　 本研究內容分為以下6個部分：
　　 1.副豬嗜血桿菌tbpA基因PCR-RFLP分析
　　 利用針對H.parasuis轉鐵蛋白基因tbpA的PCR-RFLP分型

5、方法，對2003-2008年分離自江蘇、上海、廣西、浙江、江西和安徽等6省市的57個H.parasuis分離株及15個參考菌株進行7PCR-RFLP分析，15個血清型參考菌株分為9種基因型，57個H.parasuis流行分離株分為15種基因型，其中在我國最為流行的基因型分別為DBN(38％)，ABN(18％)與DBP(12％)。該結果證明副豬嗜血桿菌在我國豬群中普遍存在，并至少有15個RFLP基因亞型，從而為我國副豬嗜血桿菌病的防治提供

6、了重要理論依據。
　　 2.副豬嗜血桿菌熱休克蛋白70基因的測序、表達與抗原性鑒定
　　 利用簡并引物首次從副豬嗜血桿菌基因組DNA中克隆獲得全長HSP70基因(GenBank登錄號為EU693116)，DNA測序結果表明，HSP70完整閱讀框1908bp，根據編碼序列推導出相應635個氨基酸。經BLAST分析表明，其氨基酸序列與溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等同源性最高，達到90％左右。將HSP70部

7、分基因克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，經酶切鑒定正確后轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達融合蛋白。SDS-PAGE表明表達的融合蛋白約46KDa，用豬抗副豬嗜血桿菌血清進行Western-blotting，結果顯示該融合蛋白具有副豬嗜血桿菌抗原性。用鎳柱親和層析法對重組蛋白進行純化，純化后的蛋白免疫小鼠，制備抗血清，Western-blot結果顯示，小鼠抗血清與該融合蛋白有明顯的特異

8、性反應條帶，證明該重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 3.共表達H.parasuis HSP70與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的構建與鑒定
　　 利用PCR擴增出高致病性PRRSV-SY0608分離株的GP3基因，按正確的讀碼框與GP5基因串聯(lián)，成功構建穿梭載體pShuttle-CMV-GP3-GP5，經PCR、測序鑒定正確。然后用兩個不同linker將副豬嗜血桿菌的HSP70基因按正確的讀碼框克隆入pShuttl

9、e-CMV-GP3-GP5，構建另外兩個穿梭載體pShuttle-CMV-HSP-GP3-GP5及pShuttle-CMV-HSP-2A-GP3-GP5。上述三個穿梭載體經PmeⅠ線性化后在BJ5183大腸桿菌內與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組，產生重組腺病毒基因組DNA。將重組腺病毒基因組DNA經PacⅠ酶切線性化后脂質體法轉染HEK-293A細胞，分別在細胞內包裝成完整的腺病毒rAd-GP35、rAd-HS35和rAd-H

10、SA35。上述三個重組腺病毒的TCIDs0分別為10-10.0/mL、10-10.5/mL和10-10.25/mL。通過RT-PCR、間接免疫熒光試驗(IFA)和Western blot可以檢測到HSP/GP3/GP5蛋白的表達，證明重組腺病毒可以正確表達目的蛋白，從而為下一步的免疫試驗打下基礎。
　　 4.共表達H.parasuis HSP70與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的小鼠免疫特性研究
　　 取75只BA

11、LB/c小鼠隨機分為5組，每組15只。第1、2組分別注射PBS或wtAd（野生型腺病毒）作為對照組，第3-5組分別背部皮下免疫重組腺病毒rAd-GP35（融合表達GP3-GP5蛋白）、rAd-HS35（融合表達HSP-GP3-GP5蛋白）和rAd-HSA35（共表達HSP-2A-GP3-GP5融合蛋白），間隔三周用同樣方法加強免疫一次。分別在首次免疫后21d、35d及49d采血測定ELISA抗體及中和抗體，分離小鼠脾淋巴細胞經PRRSV

12、抗原刺激后測定其增殖能力及分泌細胞因子的能力。結果為：3-5組小鼠在免疫后均可誘導PRRSV特異的體液和細胞免疫應答。與免疫rAd-GP35的小鼠相比，免疫rAd-HS35和rAd-HSA35的小鼠產生了更高滴度的中和抗體，二免后6周效價為1:64，并可產生較強的淋巴細胞增殖。同時，免疫rAd-HS35與rAd-HSA35的小鼠的脾細胞經體外PRRSV抗原刺激后產生了比rAd-GP35更高水平的IFN-γ(P＜0.05)和IL-4。

13、r>　　 5.共表達H.parasuisHSP70與PRRSVGP3和GP5重組腺病毒對仔豬的攻毒保護研究
　　 取20頭2-3周齡的PRRSV陰性豬，隨機分為4組，每組5頭，其中三組分別間隔三周免疫兩次重組腺病毒rAd－GP35、rAd-HS35及rAd-HSA35，另外一組按同樣方法免疫野生型腺病毒wtAd作為對照。在二免后三周用高致病性SY0608株PRRSV進行攻毒，以觀察不同重組腺病毒對仔豬攻毒的免疫保護效力。分別在

14、首次免疫后21d、42d、45d、49d和56d采血測定ELISA抗體、中和抗體、血清中細胞因子、病毒血癥等。攻毒后每日觀察并記錄臨床癥狀、測定體溫，實驗結束時對所有攻讀豬進行剖檢，觀察病理變化。結果為：免疫rAd-GP35,rAd-HS35及rAd-HSA35的豬產生了PRRSV特異性的體液免疫應答，且rAd-HSA35誘導的中和抗體滴度明顯高于rAd-GP35免疫組，差異顯著(P＜0.05)。同時，rAd-HS35及rAd-HSA3

15、5免疫仔豬血清中的IFN-γ(P＜0.05)及IL-4的含量也明顯升高。攻毒后，與wtAd和rAd-GP35免疫組相比，rAd-HS35及rAd-HSA35免疫仔豬的臨床癥狀較輕，病毒血癥較低，肺部病理變化也較輕。此外，rAd-HSA35誘導的保護效力明顯高于rAd-HS35。
　　 6.共表達H.parasuis HSP70羧基端與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的構建與小鼠免疫特性研究
　　 本研究利用PCR擴增

16、出副豬嗜血桿菌的HSP70羧基端(384-635aa)基因tHSP70，然后用兩個不同linker將副豬嗜血桿菌的tHSP70基因按正確的讀碼框克隆入重組穿梭載體pShuttle-CMV-GP3-GP5，構建另兩個穿梭載體pShuttle-CMV-tHSP-GP3-GP5及pShuttle-CMV-tHSP-2A-GP3-GP5，按上述方法，構建了兩個含tHSP70的重組腺病毒rAd-tHS35及rAd-tHSA35。RT-PCR、IF

17、A和Western blot結果證明，該重組腺病毒可以正確表達tHSP/GP3/GP5蛋白，兩個重組腺病毒病毒滴度均為10-12.0/mL。為進一步研究其免疫特性，取105只BALB/c小鼠，隨機分為7組，每組15只。第1、2組分別注射PBS或wtAd作為對照組，第3-7組分別背部皮下免疫重組腺病毒rAd-GP35（融合表達GP3-GP5蛋白）、rAd-HS35（融合表達HSP-GP3-GP5蛋白）、rAd-HSA35（共表達HSP-2

18、A-GP3-GP5融合蛋白）、rAd-tHS35（融合表達tHSP-GP3-GP5蛋白）和rAd-tHSA35（共表達tHSP-2A-GP3-GP5融合蛋白），間隔三周用同樣方法加強免疫一次。結果為：第3-7組免疫后均可產生PRRSV特異的體液和細胞免疫應答。rAd-HS35、rAd-HSA35、rAd-tHS35和rAd-tHSA35免疫組中和抗體水平、淋巴細胞增殖反應、以及IFN-γ水平均顯著高于rAd-GP35免疫組(P＜0.05