煙草核基質結合序列在轉基因遺傳穩(wěn)定性中的功能及機理分析.pdf

1、目前通過植物轉基因技術進行作物品種的改良已經成為作物品質改良的重要手段。我們都希望外源轉入的優(yōu)良基因能在作物中得到高效和穩(wěn)定的表達，但是外源的基因在轉入植物中一代或者幾代后會出現不再表達、表達變弱的現象。這種現象的發(fā)生很大程度上是由于轉基因沉默現象導致的。由于轉基因沉默嚴重阻礙轉基因商品化的進程，因此，如何提高轉基因后代的遺傳穩(wěn)定性、減少轉基因沉默的發(fā)生是一個亟待解決的問題。 核基質結合區(qū)(Matrix Attachment R

2、egions，MARs)是基因組上通常富含A/T的能夠將DNA或染色質附著到核基質上的DNA序列。通過與結合蛋白的互作，MARs在維持或修飾DNA或染色質結構及調控相關基因方面表達中發(fā)揮重要作用。以往的研究者發(fā)現核基質結合序列在減少轉基因沉默方面具有重要作用。 TM6是本實驗室從煙草核基質中分離得到的一個具有一般MARs結構特征的DNA序列，核基質體外結合實驗證明TM6與煙草核基質具有很強的體外結合能力。為了研究TM6在植物體內

3、的功能，主要是在其提高轉基因后代遺傳穩(wěn)定性中的作用，我們構建不同的植物表達載體并轉化了雙子葉植物煙草和擬南芥，對轉基因植株中TM6連接的外源基因的表達情況進行了分析。為了進一步研究TM6的作用機理，本實驗還分析了TM6對其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化的影響，主要實驗結果如下： 1.在雙子葉植物煙草中，雙TM6能夠明顯的降低雜交后代的轉基因沉默比例，提高轉基因后代的遺傳穩(wěn)定性。這個實驗結果為TM6在提高外源基因在轉基因植物中的遺傳穩(wěn)

4、定性方面的應用提供了實驗依據。 2.煙草TM6序列能夠顯著提高側翼啟動子區(qū)對核酸酶的敏感性。在DNaseI處理后的轉TM6的轉基因煙草細胞核內，TM6顯著降低了CaMV35S啟動子區(qū)域的特異擴增水平，初步說明TM6能夠減低其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化水平，從而降低基因沉默的發(fā)生，提高基因表達。 3.對轉基因煙草中CaMV35S和NOS啟動子區(qū)域的DNA甲基化程度進行檢測，分析得知：在CaMV35S啟動子區(qū)域，沒有TM6的

5、轉基因煙草植株的DNA甲基化水平較高大約在13％～37％，而有TM6的轉基因煙草植株中幾乎沒有DNA甲基化的發(fā)生；在NOS啟動子區(qū)域，沒有TM6的轉基因煙草植株的DNA甲基化水平較高大約在24％～51％，而有TM6的轉基因煙草植株的DNA甲基化水平在9％～14％左右。該實驗進一步驗證了TM6能夠顯著降低其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化水平。 4.雙子葉植物煙草中分離的TM6同樣可以在擬南芥中增強外源基因的表達，并且在不同類型的啟動子