隱孢子蟲rP23間接ELISA診斷方法及體內瞬時轉染系統(tǒng)的構建.pdf

1、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)感染動物和人引起的一種寄生蟲病,以自限性水樣腹瀉為主要癥狀。隱孢子蟲能感染170多種動物,其中哺乳動物至少有79種。隱孢子蟲卵囊在環(huán)境中普遍存在,人類可以通過多種途徑獲得感染。但目前隱孢子蟲病還沒有特效的治療藥物,因而對其進行檢測與預防很重要。
　　 本實驗利用酶切法從重組質粒pMD18-T-P23中獲得隱孢子蟲鼠基因型(Cry

2、ptosporidiummouse genotype)P23基因,克隆到pGEX-4T-1載體,構建重組原核表達質粒pGEX-P23。將鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導表達,表達產物進行SDS-PAGE和Western blot分析。結果發(fā)現(xiàn)rP23可分別與兔隱孢子蟲感染兔陽性血清、貝氏隱孢子蟲感染雞陽性血清、微小隱孢子蟲感染牛陽性血清、隱孢子蟲鼠基因型感染鼠陽性血清特異性反應,而不與兔、雞、牛、鼠陰性血清反應,

3、表明表達的重組蛋白具有良好的免疫原性。
　　 以純化的重組蛋白rP23為抗原,建立隱孢子蟲間接ELISA檢測方法,對其敏感性、特異性和重復性進行觀察；利用建立的方法,對臨床血清樣品進行檢測。結果成功地建立了隱孢子蟲間接ELISA檢測技術,其最適抗原包被濃度為2μg／mL,血清最佳稀釋倍數(shù)為1:800,酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:2000,具有良好的特異性、敏感性和重復性。利用建立的rP23-ELISA檢測方法,對23份臨床血清樣品

4、進行了檢測,并與Sheather's蔗糖漂浮法、nested PCR法檢測結果進行比較。結果顯示,建立的rP23-ELISA方法檢出率高于Sheather's蔗糖漂浮法和nested PCR法。表明該方法具有敏感性高、特異性強,重復性好、價格低廉、操作簡單、能批量檢測等特點.可用來對臨床樣品進行檢測,為研制隱孢子蟲病ELISA檢測試劑盒打下了基礎。
　　 為建立微小隱孢子蟲體外感染模型,并對其在細胞內的生長發(fā)育過程進行觀察,利用

5、人回盲腸癌細胞(HCT-8細胞)作為感染細胞,采用不同的接種細胞濃度和培養(yǎng)血清濃度進行培養(yǎng)。結果,在6孔培養(yǎng)板中接種1×106、5×105、1×105個細胞后,在24h、48h、72 h后長成70～80％單細胞層,可以用來接種1×105個微小隱孢子蟲。用含有1％血清濃度的培養(yǎng)基來培養(yǎng)微小隱孢子蟲,培養(yǎng)72 h后,通過Crypt-a-GloTM和Sporo-GloTM抗體熒光染色,成功觀察到了隱孢子蟲各個階段蟲體的形態(tài)。
　　 為

6、探索綠色熒光蛋白(EGFP)在隱孢子蟲中的瞬時表達情況,分別擴增了微小隱孢子蟲自身蛋白子孢子表面抗原CP15、熱激蛋白70、組蛋白H4、肌動蛋白、微管素蛋白和ATP酶的啟動子序列,并將外源蛋白EGFP基因置于其啟動子中,共構建了30個穿梭轉染質粒。通過電轉染導入微小隱孢子卵囊中,培養(yǎng)72h后,用流式細胞儀、熒光顯微鏡和RT-PCR檢測EGFP表達情況。結果pSEI和pAET兩個質粒轉染組流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測均觀察到EGFP熒光,R