豬偽狂犬病毒gD和gE基因的原核表達(dá)及單克隆抗體的研制.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種高度接觸性、急性傳染病。我國(guó)自1947年首次報(bào)道該病以來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化規(guī)模化的發(fā)展，已有20多個(gè)省市報(bào)道發(fā)生了該病，并在許多種豬場(chǎng)呈暴發(fā)流行趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立有效的診斷檢測(cè)方法對(duì)控制和消滅PR具有重要的意義。 本研究分離鑒定豬偽狂犬病病毒(JS株)并探索了豬體內(nèi)病毒核酸的分布

2、規(guī)律；利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PRV gD和gE蛋白；研制出針對(duì)PRV的單克隆抗體。 1、豬PRV JS株的分離鑒定及感染豬體內(nèi)病毒核酸的分布規(guī)律 用PRV特異性的引物對(duì)江蘇某豬場(chǎng)疑似豬偽狂犬病的病死仔豬組織病料進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增到特異性的條帶。以病料接種PK-15細(xì)胞，24小時(shí)即出現(xiàn)細(xì)胞病變，PCR法和病毒分離試驗(yàn)均證明所分離病毒為PRV。PRV分離株接種兔后出現(xiàn)奇癢癥狀并麻痹致死，接種仔豬后出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱，肌肉震

3、顫等癥狀，因此該分離株為強(qiáng)毒株，命名為JSZ。對(duì)自然感染發(fā)病豬臟器進(jìn)行PCR檢測(cè)，病毒在仔豬體內(nèi)廣泛分布，其中脾臟的檢出率最高，可達(dá)100％；對(duì)人工感染豬的直腸和鼻腔棉拭樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，病豬排毒最長(zhǎng)可達(dá)13天。PRV JSZ的分離鑒定為病原學(xué)研究提供了生物材料，病毒核酸排毒規(guī)律研究為病毒抗原的檢測(cè)提供依據(jù)。 2、PRV gD、gE基因的克隆及原核表達(dá) 參照Genbank發(fā)表的PRV gD和gE基因序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引

4、物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出PRV糖蛋白gD的668 bp基因片段和PRV糖蛋白gE基因去信號(hào)肽后的主要抗原區(qū)域558 bp基因片段，克隆至pET-32a的T7啟動(dòng)子的下游，分別命名為pET-32a-D和pET-32a-E，在IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，pET-32a-D和pET-32a-E均在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，重組蛋白條帶大小分別為45 kDa和43 kDa。PRV gD、gE蛋白的表達(dá)為建立PRV抗體檢測(cè)方法提供了

5、基礎(chǔ)材料。 3、PRV單克隆抗體的制備 以PK-15細(xì)胞增殖PRV，將收獲的病毒用蔗糖密度梯度超速離心法進(jìn)行純化，將純化后的抗原免疫BALB/C小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，并采用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行亞克隆，共獲得6株能穩(wěn)定分泌抗PRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2F5、2G10、3H10、4D11、684、6D5。單抗2F5亞類為IgG，其余均屬于IgM。所有單