擬穴青蟹(Scylla paramamosain)Histone 2A的基因克隆、表達及其合成肽Sphistin的抗菌特性與抗菌機理研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國南部沿海重要經濟養(yǎng)殖品種,由于缺乏擬穴青蟹的相關免疫知識,迄今無法真正實現(xiàn)擬穴青蟹的健康養(yǎng)殖?？咕念惖拿庖咭蜃釉诤Ｑ髣游锏南忍煨悦庖咧芯哂兄匾饔?因此挖掘新的抗菌肽對揭示擬穴青蟹的免疫機制具有重要的科學意義。組蛋白Histone是真核生物染色體的基本結構蛋白,一些研究證明組蛋白的成分具有抗菌活性。本實驗室在前期研究中,從LPS刺激的擬穴青蟹血細胞SSH cDNA文庫中篩選到一個

2、類似Histone2A的基因,推測其可能在擬穴青蟹體內具有抗菌等免疫功能,因而對其進行了細致的研究工作,取得了以下研究成果。
　　 ⑴闡明了擬穴青蟹Histone2A的cDNA全長序列。擬穴青蟹Histone2AcDNA序列(GeneBank登錄號為FJ774663)全長1096 bp,包含一個384 bp的開放閱讀框,編碼128個氨基酸,其理論分子量為13463.6 Da,等電點為10.58。
　　 ⑵合成肽Histo

3、ne2A具有顯著的抗菌活性,命名為Sphistin。利用生物信息學分析了擬穴青蟹Histone2A基因序列和氨基酸序列特征,通過化學合成方法合成了擬穴青蟹Histone2A N端前38個氨基酸。采用液體倍比稀釋法測定了Histone2A合成肽對8種革蘭氏陽性菌、13種革蘭氏陰性菌、2種酵母菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結果顯示Histone2A合成肽對重要的水產致病菌嗜水氣單胞菌等7種革蘭氏陰性菌、人畜致病菌金黃葡

4、萄球菌、表皮葡萄球菌等4種革蘭氏陽性菌均有抑菌作用和殺菌作用,大部分MIC濃度小于6μM,對畢赤酵母菌同樣有抑殺作用。結果表明Histone2A基因的合成肽具有生物活性,將其命名為Sphistin。用Sphistin對金黃葡萄球菌、大腸桿菌MC1061和谷氨酸棒桿菌的殺菌動力學曲線研究表明,1.5μM Sphistin可在2 h殺滅90％以上的谷氨酸棒桿菌；3μM Sphistin可在10 min殺滅90％以上的金黃色葡萄球菌;25μM

5、 Sphistin在3h可以殺滅90％以上的大腸桿菌MC1061。
　　 ⑶Sphistin對腫瘤細胞具有抑制作用。使用鼠正常成骨細胞MC3T3-E1和人肝癌細胞HepG2檢測Sphistin對細胞的毒性程度。將0-100μg/mL Sphistin分別與兩種細胞共孵24h,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),并應用MTT法檢測細胞相對活力。結果表明0-100μg/mL濃度范圍內的Sphistin對鼠正常成骨細胞MC3T3-E1沒有明顯的細

6、胞毒性；而不同濃度的Sphistin對人肝癌細胞HepG2均表現(xiàn)出抑制細胞活力的作用。將100μg/mL Sphistin與HepG2細胞共孵24 h后,細胞相對活力降低了20％。細胞形態(tài)觀察和MTT檢測細胞活性結果表明,Sphistin對正常細胞無明顯細胞毒性,而對癌細胞有抑制作用。
　　 ⑷Sphistin具有破壞細菌細胞膜的能力。大腸桿菌MC1061工程菌質粒經改造后在細菌內部表達熒光素酶,使用大腸桿菌MC1061檢測Sp

7、histin與細胞膜作用的情況。大腸桿菌MC1061與高濃度(25μM和50μM)的Sphistin作用后,熒光發(fā)光量顯著高于陰性對照蛋白組(六勝肽),表明其迅速破壞了細菌的細胞外膜結構,使細菌死亡。而大腸桿菌MC1061與較低濃度(12.5μM)Sphistin的作用后,熒光檢測結果表明低濃度的Sphistin僅是抑制了細菌的繁殖卻并未殺死細菌。高濃度和低濃度的Sphistin與大腸桿菌MC1061作用結果證明了Sphistin是一種

8、破壞細胞膜結構的蛋白,可以增強細菌細胞膜的通透性和破壞細菌細胞膜的結構。
　　 ⑸獲得了擬穴青蟹Histone2A的基因表達產物。利用pET-32a+、pET-28a+和pBV220構建了三個Histone2A基因的原核表達載體,其中pET-32a+和pBV220載體在大腸桿菌中誘導表達了Histone2A目的蛋白,帶有Trx·tag標簽的pET32a表達產物分子量30 kDa,含有283個氨基酸,等電點為9.3,為上清表達；p