禽致病性大腸桿菌強素力島缺失株的構(gòu)建及致病力評價.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，A PEC)引起的禽大腸桿菌病是一種重要的細菌性傳染病，且易與其它病原菌、病毒并發(fā)或混合感染，成為養(yǎng)禽業(yè)中重要的細菌性疾病之一。
　　 在耶爾森菌中，參與耶爾森桿菌素(yersiniabactin,Ybt,鐵載體）的合成轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)相關(guān)的毒力島稱為強毒力島（high pathogenicity island，HPI）。其包含有一個攜帶有與Ybt攝

2、取、合成和調(diào)節(jié)有關(guān)的fyuA、ybtA、irp1、irp2、irp3、irp4、irp5、irp6、irp7、irp8和irp9等11個基因的長約30.5kb的功能核心區(qū)，天門冬氨酸t(yī)RNA（asntRNA）是HPI的整合位點。近年來已有研究表明，大腸桿菌等多種腸桿菌科細菌也普遍攜帶該毒力基因群，主要具有鐵攝取與調(diào)節(jié)功能，是賦予細菌毒力和致病性的一個重要的染色體片段。
　　 為探討禽致病性大腸桿菌強毒力島（HPI）在禽大腸桿菌病

3、發(fā)病過程中的作用，以野生型致病性大腸桿菌E.coli (X0904EC02)為原始菌株，依據(jù)禽大腸桿菌強毒力島irp1~irp9基因的已知序列，利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌強毒力島irp1~irp9基因進行敲除，構(gòu)建禽致病性大腸桿菌HPI缺陷型突變體。并通過LD50的測定及病理組織切片觀察原始株與缺失株在致病力上的差異，探討HPI與致病性大腸桿菌的毒力相關(guān)性。
　　 禽致病性大腸桿菌HPI缺陷型突變體主要構(gòu)建步驟

4、為：
　　 （1）根據(jù)已知大腸桿菌HPI毒力島基因序列設(shè)計PCR敲除引物，設(shè)計的引物5′端有50bp的擬敲除基因的同源臂,3′端為擴增引物。
　　 （2）以pKD3為模板,加入高保真酶PrimeSTARHS，按照長引物PCR擴增條件擴增兩側(cè)含F(xiàn)RT位點的氯霉素抗性基因,PCR產(chǎn)物一部分經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，另一部分用DNA純化試劑盒進行純化回收，并測定DNA濃度。
　　 （3）將此線性DNA轉(zhuǎn)化入E.coli (

5、X0904EC02)感受態(tài)細胞中，在Red重組系統(tǒng)表達重組酶的協(xié)助下，含氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過其兩側(cè)的同源序列與禽大腸桿菌染色體上的基因發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性平板篩選得到陽性克隆。
　　 （4）對篩選得到的陽性克隆再導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，去除抗性基因，結(jié)合PCR擴增和測序鑒定。結(jié)果表明禽致病性大腸桿菌HPI缺陷型菌株構(gòu)建成功。由于突變株染色體上的HPI基因序列大部分己缺失，從而造成回復(fù)突變的可能性較

6、小。
　　 基于突變株構(gòu)建的基礎(chǔ)上，比較分析了突變株和其野生菌株的毒力性差異。通過LD50的測定及病理組織切片觀察，結(jié)果如下：
　　 （1）通過LD50測定結(jié)果表明含HPI的禽致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株E.coli (CVCC1565)對雛雞具有一定的致病性，不含有HPI的非致病株對雛雞不具備致病性；但在攻毒后，HPI全島缺失株E.coli (X0904EC02QS)在攻毒過程中也出現(xiàn)了少量死亡。
　　 （2）缺失株E

7、.coli (X0904EC02QS)攻毒后，病理形態(tài)學(xué)觀察也出現(xiàn)了一些相應(yīng)的病理變化，但不明顯。
　　 (3)SDSPAGE蛋白電泳檢測，發(fā)現(xiàn)出發(fā)株在鐵螯合劑2,2’聯(lián)吡啶濃度為0.3mmol/L、0.32mmol/L時，240KD處出現(xiàn)蛋白條帶，缺失株未見到任何條帶。
　　 本研究表明，APEC 毒力與HPI 存在密切相關(guān)性，攜帶HPI基因的 APEC 致病株在攻毒過程中存在不同程度的死亡，非致病性大腸桿菌沒有攜帶H