基于泥蚶血紅蛋白和microRNA應(yīng)答鎘脅迫機(jī)制初探.pdf

1、鎘(Cd)已成為海洋水域環(huán)境主要的重金屬污染物之一,是毒性最強(qiáng)的重金屬污染物。鎘對(duì)海洋生物,尤其是對(duì)底棲濾食性雙殼貝類的污染愈來(lái)愈嚴(yán)重。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)泥蚶等貝類重金屬鎘超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重,但這些體內(nèi)富集高濃度Cd的泥蚶仍能繼續(xù)存活,并沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,從組織外觀上也大多沒有出現(xiàn)畸變。泥蚶對(duì)重金屬Cd的高富集性和強(qiáng)耐受性引發(fā)了我們的興趣和思考。探討灘涂貝類在重金屬Cd脅迫下的響應(yīng)機(jī)制和調(diào)控機(jī)制,不僅為后續(xù)篩選泥蚶抗逆品系提供技術(shù)支撐,而且能從中篩選得

2、到一些指示鎘污染程度的生物指標(biāo),可補(bǔ)充作為監(jiān)測(cè)重金屬污染的手段之一。
　　本研究分成兩部分,一是在實(shí)驗(yàn)生態(tài)條件下,對(duì)鎘脅迫下泥蚶血紅蛋白濃度變化、分子水平的 mRNA表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè),探索泥蚶血紅蛋白這一特異性的蛋白與鎘脅迫之間的相關(guān)性;二是構(gòu)建鎘脅迫下泥蚶m(xù)icroRNA文庫(kù),分析泥蚶血液中差異表達(dá) microRNA以及靶基因和調(diào)控通路的預(yù)測(cè)分析。主要結(jié)果如下:
　　1.鎘脅迫對(duì)泥蚶體內(nèi)血紅蛋白濃度的影響
　　采用

3、十二烷基硫酸鈉血紅蛋白測(cè)定試劑盒(SLS-Hb方法)相結(jié)合的方法測(cè)定泥蚶血紅蛋白的濃度。結(jié)果表明,在不同濃度重金屬鎘脅迫條件下,泥蚶血紅蛋白濃度具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng),均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在25μg/L和250μg/L濃度重金屬脅迫下,在3h時(shí)血紅蛋白含量達(dá)到最高,分別為28.79μg/L、23.67μg/L;在重金屬濃度為500μg/L時(shí),實(shí)驗(yàn)組在3h和6h與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在9h時(shí)血紅蛋白含量顯著性

4、升高(P﹤0.05),血紅蛋白含量最高為23.03μg/L。初步研究結(jié)果表明,在重金屬鎘脅迫下泥蚶血紅蛋白濃度表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律,短時(shí)間內(nèi)有一個(gè)應(yīng)激的快速增加,但隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),血紅蛋白濃度呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì),為泥蚶血紅蛋白作為泥蚶Cd富集程度和重金屬鎘污染生物指標(biāo)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
　　2.鎘脅迫對(duì)泥蚶血紅蛋白mRNA表達(dá)變化的影響
　　采用熒光定量qRT-PCR法,研究鎘脅迫下泥蚶鰓中血紅蛋白mRNA的表達(dá)變

5、化,以及不同濃度梯度鎘對(duì)泥蚶鰓中血紅蛋白 mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)。Tg-HBⅠ在3h采樣點(diǎn)25μg/L是對(duì)照組表達(dá)量的3.8倍,在6h采樣點(diǎn)250μg/L實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量達(dá)到最大值是對(duì)照組的1.88倍;Tg-HBⅡA,500μg/L濃度組在3h表達(dá)量對(duì)照組的4.4倍,25μg/L、250μg/L濃度組在6h采樣點(diǎn)的表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.94、5.17倍;在6h采樣點(diǎn),三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(25μg/L、250μg/L、500μg/L)Tg-HBⅡB基因

6、的表達(dá)量分別是對(duì)照組的5.3、2.3、3.6倍。因此,初步研究表明泥蚶血紅蛋白Tg-HBⅠ、Tg-HBⅡA和Tg-HbⅡB與水體中重金屬Cd污染有一定相關(guān)性,隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),不同血紅蛋白基因在應(yīng)激時(shí)間和表達(dá)程度上存在一些差異,這一結(jié)果與血液中血紅蛋白濃度變化趨勢(shì)相似,兩者結(jié)合,可作為泥蚶重金屬污染程度的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。
　　3.泥蚶鎘脅迫下microRNA差異表達(dá)及靶向基因和通路預(yù)測(cè)
　　通

7、過重金屬鎘脅迫實(shí)驗(yàn),通過Illumina深度測(cè)序技術(shù)對(duì)泥蚶血液microRNA兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序?？傆?jì)從對(duì)照組C和脅迫組E兩個(gè)文庫(kù)中獲得了13408818和12138445條序列。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組文庫(kù)中共發(fā)現(xiàn)了215個(gè)保守的和39個(gè)新的 miRNAs。16個(gè) miRNAs的表達(dá)量在對(duì)照組和鎘處理組之間有顯著性差異。其中在鎘脅迫組中,5個(gè)miRNAs顯著上調(diào),11個(gè)顯著下調(diào)。通過qRT-PCR驗(yàn)證了其中表達(dá)最顯著的5個(gè)miRNA,即Tgr

8、-nmiR-8、Tgr-nmiR-21、Tgr-miR-2a、Tgr-miR-10a-5p和 Tgr-miR-184b,其中 Tgr-nmiR-8、Tgr-nmiR-21、Tgr-miR-2a是顯著上調(diào)(大于6倍),Tgr-miR-10a-5p和Tgr-miR-184b是顯著下調(diào)(大于5倍)。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明,差異表達(dá) miRNA的靶基因大多數(shù)與免疫應(yīng)激,這些蛋白主要涉及細(xì)胞分化、增殖、凋亡,免疫應(yīng)答,炎癥反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng)等,還有一些與