類整合素蛋白與微管蛋白在植物響應滲透脅迫中的作用.pdf

1、整合素蛋白是動物細胞粘附分子的重要成員，屬于一類跨膜蛋白的超家族，由α-亞基和β-亞基通過非共價鍵連接而成。它的胞外域能識別并結合各種含有RGD短肽序列的胞外基質分子，而在胞內域連接細胞骨架和信號分子，從而構成了胞外基質—質膜—細胞骨架連續(xù)體，成為了動物細胞內外信號轉導過程中的關鍵分子之一，在細胞的運動、增殖、分化和凋亡等方面起著重要的作用。近年來的研究表明：胞外基質-質膜-細胞骨架連續(xù)體是所有真核細胞所共有的一種結構，這種結構中的聯(lián)結

2、分子在植物、真菌和動物細胞中可能是相同或類似的。但對植物細胞內是否存在連接細胞壁組分與細胞骨架的分子，如存在，該類分子的特性又是怎樣的還知之甚少。有證據(jù)表明在植物細胞的質膜上存在類似動物細胞整合素的蛋白。 干旱等逆境引起的滲透脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要因素之一。闡明植物對滲透脅迫的響應機制，增強植物的抗性具有重要的意義。滲透脅迫導致植物細胞產生質壁分離，而細胞壁與質膜間的粘附結構對于維持植物細胞正常的生理功能至關重要，特別是在

3、對滲透脅迫的反應過程中。作為細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體的重要分子，質膜上類似于動物細胞整合素蛋白分子以及與細胞骨架間的相互作用很可能參與了滲透脅迫所誘導的許多生理生化響應過程。 本試驗以擬南芥(Arabidopsisthaliana，Columbia生態(tài)型)葉片懸浮培養(yǎng)細胞和玉米(ZeamaizeL.)幼苗為試驗材料，綜合利用分子生物學、植物生理學、生物化學和細胞生物學等技術，研究了植物細胞細胞壁與質膜間的相互作用、類整合素和

4、微管蛋白的功能、細胞學定位以及編碼類整合素蛋白和微管蛋白基因的克隆與轉化，同時研究了類整合素蛋白、細胞骨架及兩者的相互作用在滲透脅迫誘導細胞合成ABA中的作用，為進一步深入研究植物細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體在滲透脅迫信號傳導過程中的作用提供一些理論依據(jù)。主要結果如下： 1、應用差速離心和密度梯度離心分離純化細胞不同部分(膜部分和可溶性部分)，結合WesternBlotting技術分析了相關蛋白的表達。結果表明，在擬南芥懸浮細胞

5、和玉米幼苗根尖細胞的不溶性部分存在與人整合素β1亞基抗體特異反應的蛋白質帶，其分子量分別在110kDa和80kDa。用人整合素β1亞基抗體作探針，采用間接免疫熒光定位的方法，在擬南芥懸浮細胞的細胞膜和玉米幼苗根尖細胞的細胞膜與核中均檢測到了類整合素蛋白的存在。 2、等滲條件下，正常細胞的質膜與細胞壁是粘連在一起的，沒有明顯的分界線，在滲透濃度為722mmol/kg的改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h的細胞發(fā)生了局部的質壁分離，質壁分離的程度與

6、細胞所處的滲透濃度和處理時間密切相關。當RGD(胞外基質與質膜上的整合素蛋白特異結合的阻斷劑)預處理細胞后再進行脅迫處理，細胞則發(fā)生了完全的質壁分離，而用RGD類似物(不含RGD結構域)處理則不發(fā)生質壁分離，說明類整合素蛋白介導了細胞壁與細胞膜之間的粘連作用。 3、利用擬南芥懸浮細胞、原生質體及胞外基質與整合素蛋白特異結合的阻斷劑RGD及其類似物研究了細胞壁和/或細胞壁-質膜間的相互作用在滲透脅迫誘導細胞合成ABA中的作用。結果

7、表明，滲透脅迫處理顯著促進了細胞和原生質體內ABA的積累，但原生質體內ABA的積累量顯著低于細胞內ABA的積累；RGD處理顯著降低了滲透脅迫誘導的細胞內ABA的積累，但對原生質體內ABA的積累無影響；而用RGD類似物處理則對滲透脅迫誘導細胞和原生質體內ABA的積累無影響。說明細胞壁和/或細胞壁與細胞膜之間的相互作用在擬南芥懸浮細胞響應滲透脅迫和滲透脅迫誘導細胞合成ABA過程中起著重要作用。 4、采用間接免疫標記熒光的方法對擬南芥

8、懸浮培養(yǎng)細胞和玉米根細胞中類整合素蛋白和α-微管蛋白進行了熒光共定位，同時研究了類整合素蛋白和α-微管蛋白相關的作用物對類整合素蛋白與細胞骨架蛋白之間可能的相互作用。結果表明：在伸長的玉米根細胞中，微管蛋白排列與細胞的縱軸成一定角度，并彼此平行排列；而在擬南芥懸浮細胞中周質微管呈網格狀均勻而無一定方向分布。類整合素和細胞骨架蛋白相關試劑的處理試驗表明：RGD肽在阻斷植物細胞壁與細胞膜間的粘附作用的同時，也間接影響了微管與質膜的連接。微管

9、解聚劑—秋水仙堿和AlCl3以及微管穩(wěn)定劑—紫杉醇改變了細胞中微管蛋白的結構，但不影響類整合素蛋白在質膜上的排列與分布。而微絲解聚劑——細胞松弛素D除間接使微管蛋白變得松散外，也使質膜上類整合素蛋白的標記熒光變得彌散和暗淡。表明類整合素蛋白在質膜上的分布與排列受微絲排列變化的影響要高于受微管排列的影響。 5、采用RT-PCR和TA克隆或TOPO克隆的方法從野生型擬南芥(Col)中克隆出了At14a基因，并將此基因序列與35S-啟

10、動子和報告基因(GFP)相融合構建過表達載體后，再通過原生質體瞬時表達技術研究了At14a蛋白在細胞中的表達和定位。同時通過農桿菌介導的方法獲得了At14a基因過表達的轉基因擬南芥植株和懸浮細胞系。結果表明，At14a-GFP融合蛋白在原生質體中表達強度很高，在細胞水平，其表達主要在質膜部分，而在根器官水平主要在根尖表達。這些結果為深入探討該基因的功能，尤其是在植物響應滲透脅迫中的功能研究奠定了基礎。 6、按TOPO克隆的方法克

11、隆出編碼α-微管蛋白的基因(TUA2)，同時獲得了轉過表達TUA2-GFP融合基因的擬南芥植株和懸浮培養(yǎng)細胞系。轉基因植株中TUA2-GFP融合蛋白主要在根部表達，而細胞水平主要在細胞質中表達。這些結果為研究微管蛋白和類整合素蛋白間的相互作用和微管蛋白本身的功能創(chuàng)造了條件。 7、以15％PEG溶液對玉米幼苗根系分別處理不同時間(0h、12h、24h、48h)，結合熒光定位技術研究了滲透脅迫對微管蛋白排列的影響。結果表明，當細胞受

12、到滲透脅迫后，在細胞質內形成了更多的周質微管，說明微管蛋白在植物細胞響應干旱脅迫過程中起重要作用。 8、RT-PCR的結果表明，PEG處理的玉米根系細胞中Vp14基因的表達量明顯增加；紫杉醇處理和紫杉醇預處理后再用PEG處理也使Vp14表達量較對照有所增加；而先用PEG處理后再用紫杉醇處理，Vp14表達量增加更為顯著。用黃草消和PEG共處理也得出了類似的結果。對細胞內ABA含量分析結果表明，與對照相比，PEG處理24h的玉米根細

13、胞中內源ABA含量增加了3倍，單獨紫杉醇處理和紫杉醇預處理后再用PEG模擬干旱處理都使細胞內ABA含量上升了1-2倍，而先用PEG處理再用紫杉醇處理則使玉米根細胞內ABA含量比對照增加了6-7倍。說明微管骨架參與了干旱脅迫誘導ABA合成過程，且無論是解聚還是穩(wěn)定，只要改變微管的動態(tài)平衡就能導致細胞合成ABA。微管骨架動態(tài)平衡的改變很可能是通過調節(jié)ABA合成過程中關鍵酶——NCED的基因(Vp14)表達量的變化來影響ABA的合成過程。

14、 綜上所述，根據(jù)本研究的結果可以達到以下結論：(1)植物細胞中存在類似于動物細胞的整合素蛋白分子(稱為類整合素蛋白)，類整合素蛋白參與了細胞壁與質膜的相互作用；(2)細胞壁和/細胞壁與細胞膜間的相互作用參與了細胞對滲透脅迫的感知以及滲透脅迫誘導細胞合成ABA的過程，這一過程在很大程度上是通過改變與ABA合成相關酶基因的表達實現(xiàn)的；(3)微管蛋白也參與了細胞對滲透脅迫的響應過程；(4)植物細胞內存在細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體系，而且