嗜熱β-葡萄糖苷酶重組表達及纖維二糖水解特征研究.pdf

1、生物質能源作為新型的可再生能源，其發(fā)展對于緩解化石能源枯竭危機、減少日益嚴重的環(huán)境污染具有極其重要的意義。將纖維素類生物質轉化為乙醇等其他能源產品是生物質能源發(fā)展的一個重要研究方向。但是，木質纖維素的高效轉化利用仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，其中一個重要問題是生物轉化過程中所需纖維素酶的生產成本太高。通過基因工程手段，獲得性能較佳的產業(yè)化纖維素酶可以顯著降低纖維素乙醇的生產成本。我們知道，β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系的限速酶，它決定著纖維素酶整體活

2、力的高低;與溫和型β-葡萄糖苷酶相比，嗜熱型在工業(yè)應用中具有明顯的產業(yè)化應用優(yōu)勢。然而，產嗜熱β-葡萄糖苷酶的極端微生物生長所需的條件一般難以達到，所以，目前通過采用基因工程手段，實現異源表達嗜熱β-葡萄糖苷酶已成為各國的研究熱點之一。激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）作為絕對厭氧的極端嗜熱微生物，其產生的β-葡萄糖苷酶可能是日前熱穩(wěn)定性和酶活最好的β-糖苷鍵水解酶之一。因此，本研究利用大腸桿菌E.coli Roset

3、ta重組表達該嗜熱β-葡萄糖苷酶基因，激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）嗜熱β-葡萄糖苷酶基因的成功表達及其活性包涵體的成功發(fā)現，對于推進木質纖維素的高效生物轉化及酶制劑工業(yè)化生產將具有重要意義。主要研究結果歸納如下:
　　1)本論文以Pyrococcusfuriosus的基因組DNA為模板，通過PCR獲得了嗜熱β-葡萄糖苷酶基因，將其與表達載體pET24a(+)連接，成功構建了重組表達質粒pET24a(+)-P

4、F0073。
　　2)將該重組表達質粒轉化到大腸桿菌E.coli Rosetta中得到成功表達，優(yōu)化其誘導表達條件后對其水解纖維二糖的酶學性質進行表征。得出，該重組β-葡萄糖苷酶的最適pH和溫度為5.0和95℃，在pH4.0-8.0和80-90℃范圍內，具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。該重組β-葡萄糖苷酶的比酶活為222.94 U/mg，動力學常數Km值為16.9 mM，Vmax為0.6279μM/min。1mM的金屬離子（如Li

5、+、Ca2+、Co2+等）和10mM的EDTA以及糠醛對其活性影響不大，其對乙醇的耐受性良好， Ki值達到150g/L，對葡萄糖的耐受性略差，Ki值為200mM。
　　3)本研究發(fā)現，重組蛋白表達過程中形成具有水解纖維二糖能力的活性包涵體(BGL-AIBs)。在37℃和25℃條件下對BGL-AIBs的誘導表達條件進行優(yōu)化，得出兩個溫度下的最佳誘導表達條件均為OD600為1.2、誘導時間為14h、IPTG濃度為0.25mM，且兩者相