全自動(dòng)血液分析儀

1、第三章 血細(xì)胞分析儀檢驗(yàn),,,簡(jiǎn)介,手工計(jì)數(shù)法的局限性儀器優(yōu)勢(shì)：精度高、速度快、易操作、功能強(qiáng)血液分析儀發(fā)展血液分析儀功能：細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類、擴(kuò)展功能,★20世紀(jì)50年代，美國(guó)庫(kù)爾特（W.H.Coulter）發(fā)明電子血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并申請(qǐng)專利。,血液分析儀優(yōu)勢(shì)檢測(cè)項(xiàng)目多速度快精度高易操作,第一節(jié) 檢測(cè)原理,1.電學(xué)2.光學(xué),,電阻法,射頻電導(dǎo)法,,激光散射法：染色和非染色,分光光度法---檢測(cè)血紅蛋白,,一.

2、血細(xì)胞計(jì)數(shù)原理,電阻抗法,經(jīng)典的庫(kù)爾特原理,測(cè)量細(xì)胞數(shù)量和體積三分群血液分析儀主要原理,電阻抗法,血小板與紅細(xì)胞同一檢測(cè)通道特殊裝置輔助:掃流技術(shù)、鞘流技術(shù)、浮動(dòng)界標(biāo)。,射頻電導(dǎo)法,電磁波通過(guò)細(xì)胞發(fā)生衰減，與細(xì)胞內(nèi)部化學(xué)成分、核質(zhì)比、顆粒等有關(guān)。特別有助于鑒別體積相同，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細(xì)胞。,激光散射法,在不同角度測(cè)定散射光強(qiáng)度，與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部顆粒、細(xì)胞核有關(guān)。比電阻抗法分群準(zhǔn)確，是五分類儀器主要檢測(cè)原理。,,光源：氣體激光、

3、固體激光、鎢光源鞘流：流體動(dòng)力聚焦細(xì)胞懸液光檢測(cè)器,,,,,,,,,,,,1,4,3,激光散射法示意圖,1樣本流2鞘流液3激光源4透鏡5低角度散射光6高角度散射光,,,6,5,,,,2,,激光散射法,低角度散射光（前向散射光），反映細(xì)胞大小和數(shù)量。高角度散射光（側(cè)向散射光），反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒、細(xì)胞核等。流式細(xì)胞術(shù)光散射：熒光染色，得到熒光強(qiáng)度信號(hào)，與細(xì)胞所含核酸有關(guān)。優(yōu)于阻抗法，是五分類儀器的主要原理之一。,12,,

4、,,半導(dǎo)體激光,染色后的白細(xì)胞,FCM原理,激光散射法運(yùn)用,白細(xì)胞計(jì)數(shù)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)： 低角度(2°～3°)：測(cè)量紅細(xì)胞體積。 高角度(5°～15°)：測(cè)定血紅蛋白濃度。血小板計(jì)數(shù)： 低角度(2°～3°)：測(cè)量細(xì)胞大小。 高角度(5°～15°)：測(cè)量細(xì)胞密度?？膳c小RBC、RBC碎片區(qū)分。 加入熒光染色，成熟RBC無(wú)D

5、NA/RNA，不被染色。未成熟血小板染色較成熟血小板強(qiáng)。,網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)原理,對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)RNA成分染色。染色劑有：非熒光染料（新亞甲藍(lán)）和熒光染料(噁嗪、聚次甲基）非熒光染料染色法：VCS技術(shù) RNA越多光散射越強(qiáng)，可檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟度 得到參數(shù)：Ret%、 Ret#、IRF\HLR\MCVr\RDWr,網(wǎng)織紅細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)原理,熒光染料染色法 聚次甲基染RNA、噁嗪染DNA,RBC,LFR,PLT,MFR

6、,HFR,,得到參數(shù)：Ret%、 Ret#HFR\MFR\LFRIRF\ Ret-He,熒光強(qiáng)度,前向散射光,有核紅細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)原理,VCS法 非白細(xì)胞區(qū)域：有核紅、血小板聚集、大血小板、瘧原蟲(chóng)等。流式細(xì)胞激光散射法 聚次甲基熒光染色：NRBC裸核化，熒光強(qiáng)度比白細(xì)胞低。,前向散射光,側(cè)向熒光,,二. 白細(xì)胞分類原理,,白細(xì)胞三分群原理,★白細(xì)胞直方圖儀器將體積為35～450fL的血細(xì)胞，分為256個(gè)通道（c

7、hannel）。每個(gè)通道：1.64fl。根據(jù)細(xì)胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細(xì)胞體積分布直方圖(Histogram)。,★白細(xì)胞直方圖,,1.35-90fl小細(xì)胞群：淋巴2.90-160fl中間細(xì)胞群：?jiǎn)魏?、嗜酸、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細(xì)胞群：中性粒細(xì)胞,直方圖出現(xiàn)異常，不同部位有不同含義,,,,體積 電導(dǎo) 光散射,白細(xì)胞五分類檢測(cè)原理,VCS原理,VCS,,,旋轉(zhuǎn)光散射,體積,

8、激光散射法（鎢光源）、過(guò)氧化物酶染色,過(guò)氧化物酶活性強(qiáng)度：嗜酸>中性粒細(xì)胞>單核。淋巴和嗜堿細(xì)胞無(wú)過(guò)氧化酶活性,★流式細(xì)胞光散射、電阻抗、射頻、特殊細(xì)胞染色,1.4DIFF通道 阻抗+射頻：分粒細(xì)胞、淋巴、單核三群 流式光散射：溶解紅細(xì)胞、血小板，白細(xì)胞熒光染色，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞所含核酸有關(guān)。先分四群：中性粒細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞，淋巴，單核，嗜酸和未成熟粒細(xì)胞。2.嗜酸細(xì)胞通道3.WBC/BASO通道 堿性

9、溶血?jiǎng)┢茐钠渌准?xì)胞。4.IMI通道 加入硫化氨基酸，與幼稚細(xì)胞結(jié)合，且不被溶血?jiǎng)┤芙狻?,,WBC/BASO通道,完成五分類,多角度偏振光散射法（MAPSS),紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白逸出，鞘液進(jìn)入，折光系數(shù)與鞘流相當(dāng)，不干擾白細(xì)胞檢測(cè)。4個(gè)角度：0°前向散射光：細(xì)胞大小、數(shù)量10°側(cè)向散射光：細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和核染色質(zhì)的復(fù)雜性。90°偏振光：細(xì)胞內(nèi)顆粒及核分葉情況90°D垂直角度去偏振

10、散射光：鑒別嗜酸細(xì)胞,MAPSS,雙流體（雙鞘流）動(dòng)力連續(xù)系統(tǒng),雙鞘流：有2個(gè)鞘流裝置，經(jīng)第一束鞘流后用阻抗法測(cè)細(xì)胞體積，經(jīng)第二束鞘流后測(cè)定光吸收測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。1.白細(xì)胞計(jì)數(shù)通道：電阻抗2.白細(xì)胞分類通道：雙鞘流+細(xì)胞化學(xué)染色 染液中含溶血素及氯唑黑E，對(duì)單核細(xì)胞初級(jí)顆粒、嗜酸顆粒、中性顆粒及細(xì)胞膜（細(xì)胞膜、核膜、顆粒膜）染色。3.嗜堿性粒細(xì)胞通道,分光光度法,測(cè)定血紅蛋白:溶血?jiǎng)┦辜t細(xì)胞溶血，釋放出血紅蛋白，血紅

11、蛋白與溶血?jiǎng)┲心承┏煞纸Y(jié)合，形成穩(wěn)定化合物，在特定的光波（530-550nm）下比色，吸光度變化與血紅蛋白濃度成正比(Lambert-Beer比色定律)。溶血?jiǎng)?1.含氰化物：形成氰化血紅蛋白，540nm(改良HiCN 法）。氰化 物有毒。 2.不含氰化物:如SLS（月桂酰硫酸鈉）法，需用HiCN校準(zhǔn)。,方法學(xué)評(píng)價(jià),三分類已較少用五分類，準(zhǔn)確度及精密度更高。仍無(wú)法取代人工鏡檢。,,第二節(jié) 臨床應(yīng)用,紅細(xì)胞參數(shù),

12、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）反映紅細(xì)胞大小不一致的程度，與MCV結(jié)合，用于貧血的分類。RDW-SD和RDW-CV。1.鑒別均為小細(xì)胞低色素的貧血2.早期診斷缺鐵性貧血2.MCV和RDW均增高：巨幼細(xì)胞性貧血3. MCV和RDW均正常：再障、慢性失血性貧血,紅細(xì)胞參數(shù),血紅蛋白分布寬度（HDW）反映紅細(xì)胞內(nèi)HB含量異質(zhì)性。HDW和RDW明顯增高，見(jiàn)于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥（小細(xì)胞不均一性高色素）。HDW增高，RDW正常

13、見(jiàn)于輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血。球形細(xì)胞平均體積（MSCV)遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥MSCV<MCV,血小板系列參數(shù),血小板平均體積（MPV)、未成熟血小板比率（IPF) 、血小板分布寬度（PDW)MPV正常人MPV與PLT呈非線性負(fù)相關(guān)。1.鑒別血小板減低的原因： MPV增高，骨髓增生功能良好，血小板減低是由于血小板破壞過(guò)多； MPV減低，再障或急性白血病。2.評(píng)估骨髓造血功能恢復(fù)情況：造血功能恢復(fù)時(shí)，MPV增

14、高早于PLT增高。3.原發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）PLT、MPV、PDW？★ IPF網(wǎng)織血小板是胞質(zhì)中殘留RNA的血小板。鑒別血小板減低的原因：骨髓造血功能良好時(shí)， IPF增高。,網(wǎng)織紅細(xì)胞參數(shù),未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（IRF）、網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)（RMI)、Ret-He用于評(píng)估骨髓造血功能，貧血的鑒別診斷。1. IRF、 RMI ：腫瘤化療、干細(xì)胞移植骨髓造血功能受抑和恢復(fù)最早的指標(biāo)（早于WBC、PLT、Ret）

15、 IRF =(MFR+HFR）/(LFR+MFR+HFR)*100 RMI=(MFR+HFR）/LFR*1002. Ret-He網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量：反映網(wǎng)織紅細(xì)胞質(zhì)量，對(duì)缺鐵貧的治療有意義。,白細(xì)胞系列參數(shù),中間細(xì)胞群MID、未成熟粒細(xì)胞IG、造血祖細(xì)胞HPCMID：?jiǎn)魏思?xì)胞、嗜酸、嗜堿、幼稚細(xì)胞、異淋、漿細(xì)胞IG：早幼粒細(xì)胞至桿狀核粒細(xì)胞各階段，不包括原始粒細(xì)胞。HPC：干細(xì)胞移植時(shí)，檢測(cè)供體HPC變化，便于

16、選擇采集時(shí)機(jī)。,,第三節(jié) 血細(xì)胞分析儀 檢驗(yàn)圖形與臨床應(yīng)用,第二節(jié) 檢測(cè)參數(shù)和結(jié)果顯示,儀器應(yīng)滿足的兩個(gè)要求：1.篩檢和直接報(bào)告正常結(jié)果2.報(bào)警提示異常結(jié)果：結(jié)果超出范圍、細(xì)胞異常、標(biāo)本干擾等結(jié)果顯示：數(shù)據(jù)、圖形（直方圖、散點(diǎn)圖）、報(bào)警（圖形、符號(hào)、文字） 直方圖：曲線圖形，XY軸？ 散點(diǎn)圖：點(diǎn)組成的圖形，XY軸？,數(shù)據(jù),參考值,符號(hào),,,,,直方圖,★白細(xì)胞直方圖儀器將體積為35

17、～450fL的血細(xì)胞，分為256個(gè)通道（channel）。每個(gè)通道：1.64fl。根據(jù)細(xì)胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細(xì)胞體積分布直方圖(Histogram)。,★白細(xì)胞直方圖,,1.35-95fl小細(xì)胞群：淋巴2.95-160fl中間細(xì)胞群：?jiǎn)魏恕⑹人?、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細(xì)胞群：中性粒細(xì)胞,直方圖出現(xiàn)異常，不同部位有不同含義,正常白細(xì)胞直方圖,異常白細(xì)胞直方圖,,,分析白細(xì)胞直方圖應(yīng)注意：溶血?jiǎng)┨幚?/p>

18、后白細(xì)胞直方圖變化必須使用配套試劑不同儀器的直方圖不同,★紅細(xì)胞直方圖,1.近似正態(tài)分布，單峰， 36-360fl監(jiān)測(cè)，主要分布于50-200fl2.橫坐標(biāo)：細(xì)胞體積；縱坐標(biāo)：細(xì)胞的出現(xiàn)頻率3.異常圖形：左移右移、峰高低、峰寬窄、雙峰等,紅細(xì)胞異常直方圖,★血小板直方圖,1.左偏態(tài)分布，單峰，主要在2-15fl，2-30fl檢測(cè)2.異常圖形：大血小板、血小板聚集、小RBC、RBC碎片,散點(diǎn)圖-白細(xì)胞,每一條軸分別表示一種檢測(cè)原

19、理或檢測(cè)角度的細(xì)胞信息，任何一個(gè)點(diǎn)反映的是綜合信息。散點(diǎn)上下、左右、前后的變化與細(xì)胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、顆粒、胞核胞質(zhì)等有關(guān)。,散點(diǎn)圖-紅細(xì)胞,紅細(xì)胞體積/紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（V/HC）散點(diǎn)圖：分九個(gè)區(qū)，有助于貧血的分類和診斷。,,第四節(jié) 血細(xì)胞分析儀 性能評(píng)價(jià)與全面質(zhì)量控制,性能評(píng)價(jià),安裝新機(jī)或大維修后需進(jìn)行儀器性能評(píng)價(jià)，包括：精密度 批內(nèi)精密度：同一批樣本重復(fù)測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)。 批間精密度：對(duì)兩批或

20、以上樣本重復(fù)測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)。 總精密度：同一標(biāo)本多次測(cè)量的結(jié)果接近程度，包含隨 機(jī)誤差和攜帶污染率雙重變異因素。準(zhǔn)確性：測(cè)定結(jié)果與真值一致性的程度（表3-14）,準(zhǔn)確度和精密度,★性能評(píng)價(jià),線性范圍（稀釋效應(yīng)）：指測(cè)定值與稀釋倍數(shù)是否呈比例關(guān)系。線性關(guān)系范圍越寬越理想。P ＜ 0.01, 非線性相關(guān)；P ＞ 0.05，未偏離線性。,MCH,MCHC,MCV,RBC,★性能評(píng)價(jià),攜帶

21、污染率 連續(xù)測(cè)定1份高值樣本3次（i1、i2、i3）再測(cè)定1份低值樣本3次（j1、j2、j3） 攜帶污染率（%）＝（j1-j3）/（i3-J3） 可比性（儀器與常規(guī)檢測(cè)程序）： 指血液分析儀測(cè)定結(jié)果，與常規(guī)方法所測(cè)結(jié)果相比較。顯微鏡法是血細(xì)胞檢驗(yàn)基礎(chǔ)。對(duì)異常標(biāo)本和干擾物的靈敏度標(biāo)本老化：觀察標(biāo)本隨時(shí)間變化對(duì)結(jié)果的影響白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)（表3-15）,全面質(zhì)量控制,質(zhì)量保證、儀器校準(zhǔn)和性能評(píng)價(jià)均有國(guó)際公認(rèn)的

22、一系列標(biāo)準(zhǔn)文件。 質(zhì)量保證 分析前：環(huán)境、儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、參考 區(qū)間的設(shè)置、合格的檢測(cè)人員及標(biāo)本 分析中：室內(nèi)質(zhì)控、操作規(guī)范、報(bào)警處理、干擾因素分析、復(fù)檢規(guī)則 分析后：樣本保存、結(jié)果分析、征求臨床意見(jiàn)、室間質(zhì)評(píng),,,,室內(nèi)質(zhì)量控制,,質(zhì)控品要求：穩(wěn)定血制品或新鮮全血,,1,,,至少兩個(gè)水平，頻率依工作量和儀器性能而定,2,,,更換新批號(hào)應(yīng)新舊批號(hào)同時(shí)檢測(cè),3,,

23、,結(jié)果解釋：±2S（95%可信限）,4,報(bào)警,報(bào)警來(lái)源：標(biāo)本異常，超出項(xiàng)目參考范圍，符合復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)報(bào)警形式：圖形、符號(hào)、文字報(bào)警信息：（表3-18---3-21)報(bào)警處理,干擾因素分析,RBC:WBC增加、RBC凝集、大PLT、PLT聚集HB：脂血、高膽紅素、WBC高、PLT高WBC：有核紅、未溶解RBC、WBC聚集PLT：小RBC、RBC碎片、PLT聚集、大PLT、WBC碎片,復(fù)檢規(guī)則,國(guó)際血液分析儀顯微鏡復(fù)檢規(guī)則

24、41條 鏡檢三方面內(nèi)容：1.取細(xì)胞分布良好的區(qū)域，估算WBC、PLT(正?？梢?jiàn)8-15個(gè)血小板/油鏡視野 )2.白細(xì)胞分類3.血細(xì)胞形態(tài)觀察（WBC、RBC、PLT）,福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科復(fù)檢規(guī)則,鏡檢規(guī)則的驗(yàn)證,1.檢測(cè)方法：每份標(biāo)本儀器測(cè)定后由2名有工作經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行鏡檢。內(nèi)容包括：①WBC分類計(jì)數(shù)②WBC和PLT數(shù)量評(píng)估；③RBC和PLT的形態(tài)，有無(wú)PLT聚集；④其他異常：NRBC，RBC冷凝

25、集及寄生蟲(chóng)等。2.涂片鏡檢陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：① 紅系：發(fā)現(xiàn)瘧原蟲(chóng)；NRBC≥1個(gè)；或其他形態(tài)異常>2+② 血小板聚集;血小板形態(tài)異常>2+③ Dohle小體的粒細(xì)胞>2+，中毒顆粒中性粒細(xì)胞>2+，空泡變性粒細(xì)胞>2+④ 原始和幼稚細(xì)胞≥1個(gè)，早幼粒細(xì)胞和中幼粒細(xì)胞≥1個(gè) ，晚幼粒細(xì)胞>2個(gè) ⑤ 非典型淋巴細(xì)胞>5個(gè) ⑥ 漿細(xì)胞≥1個(gè)3. 統(tǒng)計(jì)要求假陰性率<5%（具有診斷意義