rna提取一般步驟總結(jié)_第1頁(yè)
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1、RNA提取一般步驟總結(jié)RNA提取原理:|通過(guò)變性劑破碎細(xì)胞或者組織,然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA,再經(jīng)過(guò)沉淀,洗滌,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶無(wú)處不在,隨時(shí)可能將RNA降解,所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意,稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。RNA提取的一般步驟所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),即:樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;有效地使核蛋白復(fù)合體變性;對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制;有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;對(duì)于多糖含量高的樣品還

2、牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸,再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái);直接在酸性條件下抽提,酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失,目前該方法的使用頻率已很低。實(shí)驗(yàn)步驟:破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行,可以用鹽酸胍、硫氰酸

3、胍、NP40、SDS、蛋白酶K等破碎組織,加入βME可以抑制RNA酶活性。2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑,加入少量異戊醇,經(jīng)過(guò)此步,離心,RNA一般分布于上層,與蛋白層分開(kāi)。3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc(pH5.2)或異丙醇。4、洗滌RNA使用70%乙醇洗滌,有時(shí),為避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能過(guò)于干燥,否則不易溶解。5、融解RNA一般使用TE。6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了

4、防止痕量RNase的污染,從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA,在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了,而從大鼠脾臟中提取的RNA,在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外,長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解

5、RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí),可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12000g離心5分鐘。I氯化鋰法提取總RNA:本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶,用氯化鋰選擇沉淀RNA,其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA,具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高小RNA片斷丟失的缺陷。試驗(yàn)試劑:1、氯化鋰尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g

6、(6M)加水至1L,過(guò)濾滅菌】2、懸浮液【10mMTrisHCL(pH7.6)1mMEDTA(pH80)0.5%SDS】試驗(yàn)步驟:1、對(duì)于大量組織或細(xì)胞,則每克組織或細(xì)胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液,勻槳器高速勻槳2分鐘;對(duì)于少量細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞ml),則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰-尿素溶液手工勻槳,并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。2、螯合劑法:螯合劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很

7、強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力,其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類(lèi)物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基,因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物,使原花色素類(lèi)物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化,并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素,在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會(huì)迅速降低。當(dāng)原花色素類(lèi)物質(zhì)量較大時(shí),單獨(dú)使用PVPP無(wú)法去除所有的這類(lèi)化合物,因而需要與其它方法結(jié)合使用

8、。3、Tris硼酸法:如果提取緩沖液中含有Tris硼酸(pH7.5),其中的硼酸可以與酚類(lèi)化合物依氫鍵形成復(fù)合物,從而抑制酚類(lèi)物質(zhì)的氧化及其與抑制酚類(lèi)物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合的結(jié)合。這一方法十分有效,所以L(fǎng)бpezGбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris硼酸濃度過(guò)高(>0.2M)則會(huì)影響RNA的回收率。4、牛血清白蛋白(BSA)法:原花色素類(lèi)物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類(lèi)似于抗原-抗體間的相互作用,形成可溶性的或不溶性的

9、復(fù)合物,減小了原花色素類(lèi)物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會(huì),因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會(huì)更好。由于BSA中往往含有RNase,因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。5、丙酮法:Schneiderbauer等用70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料,可以有效地從云杉、松樹(shù)、山毛櫸等富含酚類(lèi)化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。酚類(lèi)化合物的去除:通過(guò)Li或Ca2沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類(lèi)化合物去除。與PV

10、P、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚,可以直接通過(guò)離心去除掉,或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2丁氧乙醇(50%)來(lái)沉淀RNA,而多酚溶解于2丁氧乙醇中而被除去。然后用含50%2丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化,其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2丁氧乙醇溶液中而被去除,無(wú)需再用NaBH4來(lái)處理。多糖的干擾及對(duì)策:多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問(wèn)題。植物組織中往往富含多

11、糖,而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似,因此很難將它們分開(kāi)。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了,造成RNA產(chǎn)量的減少;而在沉淀RNA時(shí),也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀,這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水,或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性,因此污染了多糖的RNA樣品無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中,通過(guò)通過(guò)SDS鹽酸胍處理可以部分去除一鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖些多糖;在高濃度在高濃度Na或K離子存在條件下,

12、通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖離子存在條件下,通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;通過(guò)LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過(guò)這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起,所以還需要用更有效的方法來(lái)解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問(wèn)題。用低濃度乙醇沉淀多糖用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無(wú)水乙醇至終濃度10%~30%,可以使多糖沉淀下來(lái),而RNA仍保留于溶液中。

13、一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇,如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí),在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10%以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí),是在用CsCl超離心,乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30%乙醇來(lái)沉淀多糖的,進(jìn)一步純化了RNA樣品。另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入13體積的5M醋酸鉀(pH4.

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