限制性核酸內切酶

1、限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶：是識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。限制性核酸內切酶的分類：限制性核酸內切酶的分類：根據限制酶的結構輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。第一型限制酶第一型限制酶同時具有修飾(modification)及認知切割(restriction)的作用；

2、另有認知(recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位(cleavagesite)距離認知位(recognitionsite)可達數千個堿基之遠并不能準確定位切割位點，所以并不常用。例如：EcoB、EcoK。第二型限制酶第二型限制酶只具有認知切割的作用，修飾作用由其他酵素進行。所認知的位置多為短的回文序列(palindromesequence)；所剪切的堿基序列通常即為所認知的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。

3、例如：EcI、HindIII。第三型限制酶第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時具有修飾及認知切割的作用?？烧J知短的不對稱序列，切割位與認知序列約距2426個堿基對，并不能準確定位切割位點，所以并不常用。例如：EcoPI、HinfIII。限制酶在遺傳學方面的應用：限制酶在遺傳學方面的應用：1、在甚因工程方面利用能產生“粘性末端”的限制酶進行DNA的體外重組是較為方便的只要用同一限制酶處理不同來源的DNA由于所產生的水解片段具有相同的粘性末

4、端可以彼此“粘合”再經連接酶處理就成為重組DNA分子了.目前基因工程上限制酶主要應用于以下兩方面?（1）目的基因與載體的重組細菌細胞中的限制酶能水解外源DNA因此必須通過適當的載體(質粒或噬菌體)的幫助才能將外源DNA引人受體細胞并在其中增殖和表達。將供體DNA與載體用同樣的限制酶處理使載體帶上各種各樣的外源DNA片斷然后引人受體細菌細胞增殖菌細胞增殖再篩選出所需的菌株便獲得帶有某一目的基因的繁殖系.用這種方法已成功地將酵母菌的咪哇限制

5、性核酸內切酶限制性核酸內切酶NotNotⅠ一、概念：NotⅠ是一種罕見的限制性內切酶，它可識別八個堿基的核酸序列(5GCGGCCGC3)，在低鹽的情況下它還可識別(5ACGGCCGT3)。NotⅠ不僅為一普通的限制性內切酶，它在生物領域的其他方向也具有重要的應用價值及研究潛力，有關NotⅠ蛋白性質特征及功能機制等方面的報道最近日漸增多。二、應用：1.NotⅠ識別位點每65kb的隨機堿基序列中才出現(xiàn)一次，故可被用于基因組大片段的產生以及D

6、NA甲基化定位圖譜的繪制。2.因為其識別位點中富含G∶C序列，故其在真核生物基因組的GpC島上出現(xiàn)頻率較高（GpC島通常位于基因轉錄起始區(qū)域，并且是DNA甲基化的熱點區(qū)域）因此它可在很大程度上影響基因的表達。NotⅠ對甲基化相當敏感，甲基化其識別位點的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都會阻止DNA被切割。基于其低頻率性和甲基化敏感性，NotⅠ通?？杀挥糜谠诘貥嘶蚪M掃描技術(RestrictionLmarkGenomicScanning，

7、RLGS)中引進放射性標記物，這一技術已在腫瘤細胞中異常甲基化的研究中得到了廣泛應用［3］。3.在目前已被公認的各種限制性內切酶中，NotⅠ是唯一一個發(fā)現(xiàn)具有金屬結構域的蛋白酶。這一結構域由金屬離子及四面體結構的Cys4模體構成的，位于靠近DNA識別位點的區(qū)域，在維持蛋白的組織結構上起一定作用。這一研究結果表明NotⅠ有可能是隨機性核酸內切酶(其可識別更長的目的片段)與限制性核酸內切酶的中間進化產物。因此，為進行NotⅠ蛋白結構、性質及

8、機理的進一步研究，其高表達菌株的構建及高純度蛋白的大量獲得顯得極為重要。三、研究現(xiàn)狀：但目前商品化NotⅠ蛋白的價格依然居高不下，其主要原因在于表達量低、提純程序繁瑣、得率低等問題的存在，這一原因亦是造成許多其他廣泛應用的限制性內切酶價格昂貴的主要因素?，F(xiàn)在NotⅠ純化流程涉及到了磷酸纖維素陰離子交換柱、肝素瓊脂糖親和層析柱、DEAE瓊脂糖柱、PEI柱四步上柱洗脫過程，最后再將NotⅠ在其存儲緩沖液中透析過夜，整個純化流程約需3～4d，