06第6單元 體外分析技術(shù)

1、重慶醫(yī)科大學(xué) 李少林,第6章 體外分析技術(shù),臨床醫(yī)學(xué)八年制核醫(yī)學(xué)教學(xué)課件,Summary,Radioimmunoassay is a highly sensitive and specific assay method (in vitro assay) that uses the competition between radiolabeled （or unradiolabeled） and unlabeled substances

2、 in an antigen-antibody reaction to determine the concentrantion of the unlabeled substances ;It can be used to determine antibody concentrantion or to determine the concentrantion.of any substance against which specific

3、 antibody can be produced.,,,待測(cè)物質(zhì)濃度與檢測(cè)手段,臨床化學(xué)分析,,,,,,,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,常量,微量,超

4、微量,,,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展疾病診斷的革新,可在沒有任何臨床癥狀，而病人體內(nèi)發(fā)生 1. 基因表達(dá)異常； 2. 受體分布異常或受體功能改變； 3. 器官代謝異常； 4. 激素水平異常 酶、神經(jīng)遞質(zhì) ……等異常， 可早期發(fā)現(xiàn)。 體外分析和影像學(xué)的發(fā)展起了很大作用 例如 癌癥的早期診斷,放射免疫分析法的創(chuàng)立集中了放射性核素示蹤技術(shù)的高靈敏度和免疫發(fā)應(yīng)的高特異性,1959

5、 美國Yalow & Berson1960 英國 Ekim’s1977 獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎(jiǎng),開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析方法使人體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測(cè)量成為可能對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到推動(dòng)作用,R：放射性核素標(biāo)記抗原高靈敏（10 -9~ -15 g/ml）探測(cè)待測(cè)物上的標(biāo)記信號(hào) (標(biāo)記物的放大效應(yīng)),,I：免疫學(xué)反應(yīng)高特異以抗體為結(jié)合劑B:標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原競爭與同種

6、抗體結(jié)合,定 義,以放射核素標(biāo)記（或其他非放射性標(biāo)記）的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行的微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。,體外分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微量分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好、應(yīng)用面廣、方法簡便等優(yōu)點(diǎn)。,方法學(xué)基礎(chǔ),結(jié)合反應(yīng)遵守可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律： k1, v1[R]+

7、[L] [RL] k2, v2,,,定量手段,放射性測(cè)量技術(shù)酶定量技術(shù)化學(xué)發(fā)光定量技術(shù),生物學(xué)基礎(chǔ),特異性結(jié)合反應(yīng)： 抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)； 配基-受體的結(jié)合反應(yīng)； 底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)；結(jié)合體： 抗原--抗體 激素--激素結(jié)合球蛋白 受

8、體--配體,體外分析技術(shù),體外放射分析,體外非放射分析,放射性競爭結(jié)合分析,放射性非競爭結(jié)合分析,放射免疫分析 (RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化學(xué)發(fā)光免疫分析,熒光免疫分析,,,(IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),,,,放射免疫分析法(radioimmunoassay),Dr. Yalow,在體外條件下, 利用Ag與定量的*Ag對(duì)限量的特異性Ab的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測(cè)定放射性復(fù)合物的量來計(jì)算出A

9、g 量的一種超微量分析技術(shù)。,基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,,,,,+,+,*Ag-Ab + *Ag,(B),(F),*Ag與Ag 免疫活性相同*Ag＋Ag > Ab,,,,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

10、,,,Ag,25,50,100,200,400,800,,,,,,,*Ag,,,,,,,Ab,,分離B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,,,,,,,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,濃度,B%,,標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線,Ag,25,50,100,200,400,800,,,,,,,*Ag,,,,,,,Ab,,分離B、F,,,,,,,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,

11、1,2,3,4,5,6,,,,,,,B%,？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,60,1．最大結(jié)合管（Bo） 標(biāo)準(zhǔn)抗原的量為0，只有標(biāo)記抗原和特異性抗體時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測(cè)得的B的放射性為Bo。這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競爭時(shí)，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達(dá)最大值。2．非特異結(jié)合管（NSB） 標(biāo)記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對(duì)我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特

12、異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測(cè)得的放射性。,在實(shí)際的操作中，我們一般要設(shè)立以下幾個(gè)反應(yīng)管：,3．總放射性管（T） 反應(yīng)后不分離就直接測(cè)得的放射性就是總放射性。表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性。4．標(biāo)準(zhǔn)管（B1~Bn） 放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，再加入相同量的標(biāo)記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測(cè)定沉淀的放射性作為B。5．樣品管（Bx） 用同劑量的樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀

13、測(cè)得其放射性，就可以在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品的濃度。,常用的有B%，B/F，B/Bo，F(xiàn)/B，Bo/B等這些反應(yīng)變量都可以用作縱坐標(biāo)來對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，選用的反應(yīng)變量不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀也不同。但是這些標(biāo)準(zhǔn)曲線都是反映的反應(yīng)變量對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度變化而變化的函數(shù)關(guān)系。,標(biāo)準(zhǔn)曲線左：橫座標(biāo)為等份刻度；　右：橫座標(biāo)為對(duì)數(shù)刻度,操作基本步驟,加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對(duì)象孵育的溫度

14、和時(shí)間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法分離游離抗原和抗原－抗體復(fù)合物。測(cè)量：測(cè)量游離或結(jié)合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)物濃度的計(jì)算。,基本方法,基本試劑,1.抗體,2.標(biāo)記抗原,3.非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）,,,2.標(biāo)記抗原,1）比活度和放化純度足夠高,比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）,放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。 >90%,2）半衰期足夠長,

15、3）保持原有抗原的特性,大分子：125I小分子：3H or 125I,3.非標(biāo)記抗原 （標(biāo)準(zhǔn)品）,化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測(cè)抗原相同,高純度,,B和F的分離,1.第一類,2.第二類,雙抗體沉淀法,PEG沉淀法,固相第二抗體法,,,,,,,+,,,Ag,Ab(1),Ab(2),,,,,Ab(2),Ab(1),Ag,,,,,,可溶性復(fù)合物,可沉淀復(fù)合物,試管,試管,分離方法的要求,分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分

16、離過程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、pH值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價(jià)廉。,質(zhì)量控制（quality control）,1.精密度（precision） 變異系數(shù)（ CV ）7%~10%,2.準(zhǔn)確度（accuracy） 回收率=測(cè)定值/真實(shí)值×100% 90%~110%,3.靈敏度 （sensitivity） 方法的最小可測(cè)量,4.特異性（specif

17、icity） 交叉反應(yīng)率,,5.可靠性（validity） 平行性試驗(yàn),6.穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75,,,A,B,C,,質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測(cè)量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。 具體作用有：1．檢查誤差的程度，決定測(cè)定結(jié)果的取舍。2．識(shí)別誤差的來源并消除其原因。3．改進(jìn)測(cè)定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。,RIA小

18、結(jié),靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡便,免疫放射分析法,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,,,（immunoradiometric assay,IRMA）,B%,,,,,Ag,（B）,（F）,在體外, 利用Ag與過量的*Ab的非競爭性結(jié)合反應(yīng)，通過測(cè)定放射性復(fù)合物的量來計(jì)算出Ag 量。標(biāo)記抗體，抗體是過量的。,IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別,B%,,,,B%,,,,,,,擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合的NSB,擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線

19、,擬合的NSB,IRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線,RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線,IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖,非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù),酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù),酶標(biāo)記免疫分析技術(shù) 用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)。其中應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。 是結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感

20、性的檢測(cè)技術(shù)。,ELISA方法是用酶分子標(biāo)記抗體，進(jìn)行與IRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計(jì)測(cè)定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。 常用的酶是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) ，反應(yīng)后顯黃色。,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析

21、技術(shù)。 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時(shí)將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。,1.化學(xué)發(fā)光免疫分析 是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，反應(yīng)以后，利用堿性條件下化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測(cè)光子的數(shù)量就可以反映復(fù)合物的量。 常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是異魯米那和吖啶酯。,2.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 和ELISA相似，用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，經(jīng)夾心法

22、免疫反應(yīng)后，帶有酶的復(fù)合物作用于特殊的底物--金剛烷，使底物發(fā)射出光子。 此法光子發(fā)射持續(xù)時(shí)間較長，可靠性比較好。,3.電化學(xué)發(fā)光免疫分析(略) 4.生物發(fā)光免疫分析(略),時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）,時(shí)間分辨熒光免疫分析采用稀土元素標(biāo)記抗體，利用時(shí)間分辨熒光儀特定的延遲時(shí)間測(cè)量，獲得稀土元素的特異熒光信號(hào)，同時(shí)消除非特異性熒光物質(zhì)的干擾。,標(biāo)記物為具有獨(dú)特

23、熒光特性的稀土金屬—鑭系元素,鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)種有四種 釤（Sm），銪（Eu），鏑（Dy），鋱（Te）鑭系元素?zé)晒庵匾攸c(diǎn)： 1.極長的熒光衰退時(shí)間 銪：730000ns，釤：50000ns，一般熒光物質(zhì)：10ns 2.200nm的Stokes位移 銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm 熒光素的Stokes位移為273

24、nm 3.狹窄的發(fā)射峰 4.解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍,時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）,基本原理,鑭系元素（15）：銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy），鋱（Te）,,,Eu,,+,,,,,,,Eu,,,,Eu,+,,增強(qiáng)液,,,,,+,“解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析”,,時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的基本原理示意圖,熒光衰退時(shí)間銪：730000 ns釤：5

25、0000 ns一般熒光物質(zhì)：10 ns,銪的熒光,TrFIA的特點(diǎn),1.最大限度提高測(cè)量方法的靈敏度2.有與RIA相似的特異性和精密度3.可同時(shí)測(cè)定兩種以上的抗原4.無輻射污染,DELFIA技術(shù)的特點(diǎn)為臨床檢測(cè)帶來的先進(jìn)性,總結(jié) 體外分析的發(fā)展,方法設(shè)計(jì)的改變：競爭結(jié)合分析 非競爭結(jié)合分析，代表方法是免疫放射分析標(biāo)記物的改變：放射性核素 熒光、酶、化學(xué)發(fā)光、稀土元素結(jié)合體

26、的改變,,,微生物 ——RMA 酶 ——REA 受體 ——RRA 特異結(jié)合蛋白 ——CPBA 改變結(jié)合體對(duì)放射性技術(shù) Ag Ag-Ab RIA + Ab免疫學(xué)技術(shù)

27、 ※Ag ※Ag-Ab 改變標(biāo)記物第一階段 第二階段 第三階段,,,,,,,,,,,小分子半抗原聯(lián)接125I單克隆技術(shù)固相技術(shù)藥品化Kit,理論與實(shí)踐上更豐富更完善的RI