bacillussp.s65殼聚糖酶分離純化及基因克隆研究

1、中國科學院合肥物質科學研究院博士學位論文Bacillus sp.S65殼聚糖酶分離純化及基因克隆研究姓名：蘇彩欣申請學位級別：博士專業(yè)：生物物理指導教師：余增亮20070310P u r i f i c a t i o na n d G e n eC l o n i n g o f a C h i t o s a n a s e f r o mB a c i l l u s s p ．S t r a i n $ 6 5 A b s t

2、r a c tA b s t r a c tC a i x i n S u ( M a j o r ：B i o p h y s i c s )D i r e c t e db yP r o f ．Z e n g l i a n g Y uC h i t i n ，t h eB ·( 1 ·4 ) 一l i n k e dh o m o p o l y m e r o f N —a c e t y l —D g l

3、u c o s a m i n e ，i st h es e c o n dm o s t a b u n d a n tp o l y s a c c h a r i d e w h i c hi s o n l y n e x tt o t h a t o fc e l l u l o s e ．C h i t o s a n ，aD —g l u c o s a m i n e p o l y m e r , i s t o t

4、a l l y o r p a r t i a l l y d e a c e t y l a t e d d e r i v a t i v e o f c h i t i n ．C h i t o s a nC a nb ec o n v e r t e dt o w a t e r s o l u b l eo l i g o s a c c h a r i d e sb y c h e m i c a l o re n z y

5、m e ．W i mi t s a d v a n t a g e s i n e n v i r o n m e n t a l c o m p a t i b i l i t y , l o wc o s t a n dr e p r o d u c i b i l i t y ,c h i t o s a n a s eh y d r o l y s i sb e c o m e sm o r e a n d m o r ep o

6、 p u l a ri nr e c e n ty e a r s ．H o w e v e r , t h eu t i l i t yo f c h i t o s a n a s e i ns u c h h y d r o l y s i si sl i m i t e db e c a u s e o fi t sc o s ta n d u n a v a i l a b i l i t yi nb u l k q u a

7、n t i t y ．F o rt h e p r o d u c t i o no f o l i g o s a c c h a r i d e s f r o m c h i t o s a n ，ac h i t o s a n a s e —p r o d u c i n gb a c t e r i u m ，$ 6 5 ，w a si s o l a t e df r o ms o i l ．O nt h e ．b a s

8、 i s o f p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa n d16 Sr D N A g e n es e q u e n c e ，$ 6 5W a si d e n t i f i e da sa B a c i l l u s 。s p ．s t r a i na n d b e l o n g s t oB a c i l l u sc e r e u sg r o u p ·

9、$ 6 5 c h i t o s a n a s e W a sh o m o g e n e o u s l yp u r i f i e db y D E A E S e p h a r o s ef a s tf l o w a n i o ne x c h a n g ef o l l o w e db yS u p e r d e x7 5 s i z e e x c l u s i o n ，a n dt h em o l

10、 e c u l a rw e i g h t ’W a s4 5k D a a c c o r d i n g t oS D S - P A G E ．E n z y m e a n a l y s i ss h o w e d t h a t t h eo p t i m u mp H a n dt e m p e r a t u r eo f $ 6 5 w e r e6 ．0a n d 6 5o C ，r e s p e c t

11、 i v e l y ．T h cp Io f c h i t o s a n a s eW a S a b o u t6 ．0 - 6 ．5 ．C h i t o s a n a s ea c t i v i t yw a sa s s a y e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f m e t a l i o n s ．R e s u l t s s h o w e d t h a t w h

12、 e n t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e d f r o m1 t o 1 0 m m o l ／L ，M n 2 + c o u l d s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e t h ee n z y m e a c t i v i t y ．A f t e r p r i m e rd e s i g n ，a13 6 3 b p s e q

13、u e n c ew a s a m p l i f i e db yP C R m e t h o d ．A n a l y s i sw i t h s o f t w a r e D N A m a ni n d i c a t e d a l l o p e n r e a d i n gf r a m e a n de n c o d e da4 5 7 4 0 D ae n z y m e ．E c o l ie x p r

14、 e s s i o nv e c t o rp E T 2 2 b ( + ) w a sc o n s t r u c t e db yd o u b l e e n z y m ed i g e s t i o na n dd i r e c tc l o n i n gm e t h o d i no r d e rt o i m p r o v ec h i t o s a n a s ey i e l db y g e n

15、e r e c o m b i n a t i o n ．’B a c i l l u ss p ．$ 6 5c e l l sw e r em u t a t e db ya n o v e lm u t a g e n ，n i t r o g e n i o nb e a m ．O n em u t a n t ，$ 6 5 F 5w i t hh i g hy i e l do fc h i t o s a n a s ew a