hla-a胞外區(qū)成熟肽基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建

1、第 3 5 卷第 6 期 2 0 0 9年 1 2月 湖南農(nóng) 業(yè)大 學(xué)學(xué) 報(bào)( 自然科 學(xué)版 )J o u r n a lo fH u n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y( Na t u r a lS c i e n c e s )Vl 0 l I 3 5NO ． 6De c ． 2 0 0 9文章編號(hào) ：1 0 0 7 — 1 0 3 2 ( 2 0 0 9 ) 0 6 -

2、0 6 6 8 · 0 5H L A ． A胞外區(qū)成熟肽基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建 張 蕾 ，李新生 ，崔保安 ，陳紅英 ，孫 凱 ，宋亞鵬 ( 1 ． 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧 醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 4 5 0 0 0 2 ； 2 ． 河南省動(dòng)物性食 品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河南 鄭州 4 5 0 0 0 2 )摘 要 ： 根據(jù) G e n B a n k 基因庫(kù)中 H L A — A胞外區(qū)成熟肽基因序列設(shè)計(jì) 2 對(duì)引

3、物， 用 R T - P C R法從健康人血液中擴(kuò) 增 H L A ． A胞外區(qū)基 因 ， 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 T _ A克隆 、測(cè)序．結(jié)果表明 ，獲得 的 H L A ． A胞外 區(qū)基 因大小為 8 1 9b p ，與模板序列的 同源性為 9 6 ％．利用基 因重組技術(shù) ， 將 H L A — A胞外區(qū)基因亞克隆人 p E T - 2 1 a ( + ) 載體 中．經(jīng) P C R 、酶切和測(cè)序鑒定 ， 證實(shí)所獲重組表達(dá)質(zhì)粒 p E T -

4、2 1 ／ H L A ． A 中含有 目的片段 ，且連接 、構(gòu)建正確 ，表明成功構(gòu)建 了重組表達(dá)質(zhì)粒 p E T - 2 1 ／ H L A — A ．關(guān) 鍵 詞：H L A — A胞外區(qū)；成熟肽基因；克??； 原核表達(dá) 中圖分類號(hào)：$ 8 5 1 ． 3 1文獻(xiàn)標(biāo) 志碼 ：AGe n ec l o n i n ga n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rc o n

5、s t r u c t i o no fHLA- A m a t u r ep e p t i d eo fe x t r a c e l l u l a rd o m a i ng e n eZHANG Le i’ 2 ， LIXi n ． s h e n g， CUIBa o ． a n，， CHE N Ho n g ． y i n g’，S UN Ka i，， S ONG Ya ． p e n g，( 1 ． C o l l

6、 e g eo f A n i ma lH u s b a n d r ya n dV e t e r i n a r yMe d i c i n e ， He n a nA g r i c u l t u r a lUn i v e r s i t y , Z h e n g z h o u4 5 0 0 0 2 ， C h i n a ；2 ． Ke yL a b o r a t o r yf o rA n i ma lF o o

7、dS a f e t yo fH e n a nP r o v i n c e ， Z h e n g z h o u4 5 0 0 0 2 ， C h i n a )Ab s t r a c t ： T wop a i r so f p r i me r s we r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h er e f e r e n c ee x t r a c e l l u l a r

8、d o ma i no f HL A- A ac h a i nma t u r ep e p t i d eg e n e sf r o m Ge n Ba n k ， T h ee x t r a c e l l u l a rd o ma i ng e n ewa sa mp l i f i e df r o m t h eb l o o do fh e a l t h yp e o p l eb yu s i n gR T

9、- P CR． P CR p r o d u c twa sc l o n e di n t ot heTe a s yv e c t o ra n ds e q u e n c e d ． T h es e q u e n c i n gr e s u Rs h o we dt h a tt het a r g e tg e n ewa s8 1 9b pa n dt heh o mo l o g yb e t we e nt he

10、e x t r a c e l l u l a rd o ma i ng e n ea n dt het e mp l a t er e a c h e d9 6 ％ ．T h ee x t r a c e l l u l a rd o ma i ng e n ewa ss u b c l o n e di n t op E T - 21a( + ) v e c t o r ． T h er e c o mb i n a ntp l a

11、 s mi dp E T - 21 ／H L A — Aw a si d e n t i f i e db yP CR， DNA r e s t r i c t i o na n ds e q u e n c i n g ． T h er e s u l ts h o we dt h a tt h er e c o mb i n a n tp l a s mi dp E T - 2 1 ／ HL A— A wa sc o n n e

12、c t e da n dt e d c o n s t r u c t e dc o r r e c t l y ， wh i c hp a v e dt h ewa yo ft h ep r e p a r a t i o no fHL A- A — P e p t i d eT e t r a me ra n dt h er e s e a r c ho ni t sr o l ei na n t i g e ni d e n t

13、i f ic a t i o na n di mmu n er e s p o n s e ．Ke ywo r d s ：HLA· A e x t r a c e l l u l a rd o ma i n； ma R n ' ep e p t i d eg e n e ； c l o n i n g ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n主要組織相容性復(fù)合體( ma j

14、 o rh i s t o c o m p a t i b i l t yc o m p l e x ， MH C ) 是脊椎動(dòng)物中編碼免疫應(yīng)答直接相 關(guān)的高度多態(tài)的基因群? ．根據(jù)結(jié)構(gòu)和化學(xué)功能的不同， 將 MH C分為 MH C ． I 類 、 MH C ． I I 類和 MH C 一Ⅲ類 區(qū) ，它們 在免疫反應(yīng)中起著重要作用．人 的MH C 叉 稱 人 類 白 細(xì) 胞 抗 原 ( h u ma nl e u k o c y t e

15、a n t i g e n ，H L A ) ．MH C — I類分子存在于所有有核細(xì) 胞的表面，由重鏈 鏈) 和輕鏈( 1 3 2 m ) 組成，p 2 m與 重鏈 以非共價(jià)鍵形式結(jié)合 ，以維持 MH C ． 1分子的 收稿 日期 ：2 0 0 9 ． 0 7 。 1 5基金 項(xiàng) 目：“ 十一 五 ” 國(guó)家科 技 支撐 計(jì) 劃項(xiàng) 目( 2 0 0 6B AD 0 6 A 0 8 )作者簡(jiǎn)介：張 蕾( 1 9 8 4 一) ，女 ， 河

16、南滎 陽(yáng)人 ， 碩士研 究生 ， 主要從事分子免疫學(xué)和分子病毒學(xué)研究 ．天然構(gòu)型及在細(xì)胞表面表達(dá)的穩(wěn)定性【 2 j ．其中 鏈 由 0 【 1 、0 【 2和 0 【 3 個(gè)胞外區(qū)( 功能區(qū)) 和跨膜區(qū)及胞 內(nèi)區(qū)組成．0 【 l 、2 結(jié)構(gòu)域?qū)λY(jié)合 的肽起 固定作用，其氨基酸組成和排列順序變化最大 ， 是 MH C — I 類 分子多肽性的基礎(chǔ)．3結(jié)構(gòu)域則是 MH C — I 類分子 與 C D 8 分子相互作用的位點(diǎn)．MH C —

17、I 類分子的重 鏈 、p 2 m 及抗原多肽形成復(fù)合體遞呈到細(xì)胞表面，并與細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞( C T L ) 表面的T 細(xì)胞受體( T C R )相互作用 ， 在一些輔助分子和共刺激受體分子的參 與下， 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異細(xì)胞免疫應(yīng)答【 3 4 】 ．自1 9 9 6 年A l t ma n [ 5 ] 建立可溶性 MH C ． 肽 四聚體 技術(shù)( MH C — p e p t i d et e t r a m e r ) 以來 ，該技

18、術(shù) 已在人 ( H L A )制 、小 鼠( H 一 2 )、l ~ ( Ma m u )、黑猩猩 6 7 0湖南農(nóng) 業(yè)大學(xué) 學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版)2 0 0 9 年 1 2 月因． 反應(yīng)程序同 1 ． 4 ． 2 ． 擴(kuò)增后用 1 0g m 瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè) ， 回收特異的 D N A條帶．用 N h e I 和 X h oI 雙酶切 回收 P C R產(chǎn)物 ，電泳 、 分離和 回收 目的基 因．將 H L A — A 胞外 區(qū)片段定

19、向插入到經(jīng)同樣處理 的原核表達(dá)載體 p E T - 2 1 a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 p E T一 2 1 ／ H L A — A ．轉(zhuǎn)化 E ． c o l iD H 5 o t 感受態(tài)細(xì)胞 ，涂布于含氨芐青霉素 L B平板 ， 3 7℃培養(yǎng)過夜．挑 選單個(gè)菌落， 接種到 A m p的 L B肉湯培養(yǎng)基中， 3 7℃振蕩培養(yǎng) 1 2 ～ 1 6h ．提取重組質(zhì)粒 ，進(jìn)行 P C R擴(kuò) 增和用 N h eI和X h oI 進(jìn)行酶切鑒定．將

20、 P C R和酶 切鑒定為陽(yáng)性的重組菌進(jìn)行測(cè)序鑒定．2 結(jié) 果 2 ． 1H L A 。 A胞 外區(qū)基 因的擴(kuò)增 結(jié)果 取 5l x L P C R產(chǎn)物 ，在 1 ％ 瓊脂糖凝膠上電泳 ，在約 8 2 0b p 處可見 1 條特異性條帶( 圖 1 ) ，與預(yù)期 結(jié)果相符，m 1220 0 0b p10 0 0b p7 5 0b p5 0 0b p2 5 0b p1 0 0b pm DN A Ma r k e r D L2 0 0 0

21、 ； 1R T - P C R 產(chǎn) 物 ； 2 ． 陰 性 對(duì) 照 圖 1P C R產(chǎn)物電泳 圖譜 F i g ． IEl e c t r o p h o r e s i sma pf o rP CR p r o d u c t2 ． 2 重組質(zhì)粒 p G E M ． T ／ H L A ． A的 P C R 及酶切鑒定抽提重組質(zhì)粒 p G E M． T ／ H L A — A，進(jìn)行 P C R擴(kuò) 增 、電泳 ，同樣也出現(xiàn) 1 條長(zhǎng)約

22、 8 2 0b p的特異條 帶． 因?yàn)?目的片段的兩側(cè)分別含有 1 個(gè) E c o RI 酶切 位點(diǎn)， 所以重組質(zhì)粒經(jīng) E c o RI 雙酶切產(chǎn)物電泳出現(xiàn) 2 條帶 ， 其 中 1 條帶為載體質(zhì)粒 ， 約 30 0 0b p ， 另 1條帶為所克隆的 H L A — A 胞外區(qū)基因片段 ，約 8 2 0b p ( 圖 2 ) ，與預(yù)期結(jié)果相一致．2 ． 3 重組表達(dá)質(zhì)粒 p E T ． 2 1 ／ H L AA的鑒定 抽提重組質(zhì)粒 p

23、 E T - 2 1 ／ H L AA， 進(jìn)行 P C R鑒定 ，20 0 0b p10 0 0b p7 5 0b p5 0 0b p2 5 0b pl 0 0b p6 2 2 3 b p34 7 2b pmD N A Ma r k e r D L2 0 0 0 ； 1P C R產(chǎn)物； 2 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M - Ec o T1 4I d i g e s t圖 2 重組質(zhì)粒 p G E M ． T ／ H L A - AP C R

24、 和酶切鑒定結(jié)果 F i g ． 2I d e n t i f i c a t i o no fr e c o mb i n a n tp l a s mi db yd i g e s t i o n( E e o R I1a n dPCR 電泳出現(xiàn) t 條長(zhǎng)約 8 2 0b p 的特異條帶 ； 提取的質(zhì)粒 經(jīng) N h eI 和 X h oI 雙酶切、 電泳 ， 出現(xiàn) 2 條帶 ， 其 中l(wèi) 條帶為載體質(zhì)粒 ，約 53 6 9b p

25、，另 1 條帶為所克 隆的 H L A ． A胞外區(qū)基因片段 ，約 8 2 0b p ( 圖 3 ) ， 與 預(yù)期結(jié)果相一致．將鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè) 序 ， 結(jié)果 p E T - 2 1 ／ H L A — A5端起始密碼子( A T G ) 和 3端終止子( T G A ) 及兩側(cè) N h eI 和X h oI 限制性內(nèi)切酶 的識(shí)別序列均完整 ， 且讀碼框正確 ， 表明重組表達(dá) 質(zhì)粒 p E T - 2 1 ／ H L A —

26、A構(gòu)建成功．m 12M 20 0 010 0 075 05 0 02 5 0l 0 0 62 2 3b p34 7 2b pmD N AMa r k e r D L2 0 0 0 ； 1P C R產(chǎn)物； 2 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M ~ ． - E c o T1 4Id i g e s t圖 3 重組質(zhì)粒 P C R和酶切鑒定結(jié)果 F i g ． 3I d e n t i f i c a t i o no fr e c o mb i