KIT信號通路在光誘導視網膜損傷過程中的功能及機制研究.pdf

1、視網膜變性是一類因視網膜神經細胞逐漸發(fā)生退行性變性而導致視力喪失的異質性疾病，主要因感光細胞發(fā)生凋亡而致盲,目前尚難治愈。近年來，越來越多的研究發(fā)現視網膜自身存在神經保護機制，主要通過神經營養(yǎng)因子來阻斷自身細胞的凋亡或增強細胞的存活能力，進而維持視網膜發(fā)揮正常的視覺功能。因此，激活視網膜內源性神經保護機制被認為是治療視網膜變性疾病的合適策略之一。目前，已發(fā)現多種神經營養(yǎng)因子能有效地抑制小鼠遺傳性視網膜退行性變性，曾給視網膜變性疾病的治療

2、帶來曙光，但因其帶來的系統(tǒng)性副作用以及對視網膜產生的保護作用的分子機制不明等因素依舊制約著常規(guī)的臨床應用，且對視網膜變性疾病的治療效果依舊不理想。因此，尋找更多新的視網膜保護因子具有迫切性和必要性。為尋找新的視網膜保護因子，本文通過利用小鼠光損傷模型及基因表達譜芯片分析，首次發(fā)現光損傷誘導了KITL在感光細胞中表達明顯上調，并促進了其受體KIT的磷酸化水平明顯升高，提示KIT信號通路在光誘導視網膜損傷過程中被激活。酪氨酸激酶受體KIT介

3、導的信號通路在血細胞形成、配子形成、黑色素細胞發(fā)育等過程中均發(fā)揮著重要的生理功能，但在視網膜中的生物學功能，尚未見到相關報道。為了分析KIT信號通路在光誘導視網膜損傷過程中的功能，我利用Kit-Wps突變小鼠模型（以下簡稱為Wps），通過眼內注射KITL結合Western Blot和免疫熒光實驗，發(fā)現Wps突變抑制了視網膜中KIT對KITL的應答而阻斷了KIT信號通路的活性；隨后通過光損傷處理結合視覺神經電生理檢測、視網膜組織形態(tài)學分析

4、以及TUNEL細胞凋亡檢測等，發(fā)現Wps突變在正常光照條件下未引起視網膜明顯的異常，但在強光照條件下卻促進了光誘導的視網膜退行性變性，揭示KIT信號通路在光誘導視網膜損傷過程中抑制感光細胞凋亡，從而發(fā)揮著重要的視網膜神經保護功能。
　　本研究主要內容包括：⑴氧化損傷被認為是神經變性疾病的共同特征之一，同樣也出現在光誘導視網膜損傷過程中。感光細胞具有大量的線粒體和脂質，在強光照環(huán)境下產生大量的活性氧而引起一系列的氧化損傷反應，最終導

5、致感光細胞發(fā)生凋亡。本博士論文研究通過對活性氧以及MDA所修飾蛋白的含量檢測，發(fā)現Wps突變促進了光誘導的活性氧生成以及MDA修飾蛋白的含量，提示Wps促進光誘導的視網膜氧化損傷；隨后通過視網膜外植體培養(yǎng)以及感光細胞661W細胞系體外研究結果均顯示， KITL能夠有效地抑制H2O2誘導的感光細胞凋亡。這些結果提示KIT信號通路影響光誘導的視網膜氧化損傷，并在視網膜中起到抗氧化作用。⑵為解析KIT信號通路在光誘導視網膜損傷過程中所調控的下

6、游靶分子，研究分析了抗氧化基因在光誘導的Wps純合子小鼠視網膜中的表達情況，發(fā)現光損傷在野生型小鼠視網膜中能夠誘導血紅素氧化酶1（Hmox1）的表達明顯上調，但Wps突變則抑制了光誘導的Hmox1表達，說明光誘導的Hmox1的表達依賴KIT信號通路；為進一步明確該信號通路對Hmox1表達的調控，本研究運用體外基因過表達技術結合Western Blot等檢測方法，發(fā)現在感光細胞661W細胞系中過表達野生型的KIT能夠明顯上調HMOX1的表

7、達，而過表達野生型KIT對HMOX1表達的調控作用明顯下降，說明該信號通路在感光細胞中調控Hmox1的表達，同時Wps突變降低了KIT對Hmox1的表達調控作用。最后，為明確Hmox1在光誘導視網膜損傷過程中的功能，本研究通過眼內注射結合腺相關病毒AAV8-CMV-Hmox1介導的基因過表達技術，發(fā)現外源性過表達HMOX1能夠抑制強光誘導的Wps純合子小鼠視網膜退行性變性以及視覺功能的退化，揭示該信號通路可通過調控HMOX1來發(fā)揮視網膜