銅綠假單胞菌las群體感應系統(tǒng)反義肽核酸的構建及其生物學作用研究.pdf

1、目的：
　　1.針對銅綠假單胞菌las群體感應系統(tǒng)的lasR和lasI基因，設計和篩選出與其mRNA緊密結合的反義寡核苷核酸序列，以此為基礎設計合成反義肽核酸。
　　2.評估反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1的生長、lasR和lasI基因表達、生物被膜形成及毒力因子表達的影響。
　　方法：
　　一、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設計與篩選
　　1.銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI

2、基因反義寡核苷酸的設計與篩選
　　1.1目的基因的擴增:根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI全長基因序列，用軟件Primer Primer6.0設計擴增引物，進行l(wèi)asR和lasI基因的PCR擴增。
　　1.2構建lasR和lasI基因mRNA表達質粒:回收并純化lasR和lasI基因擴增產(chǎn)物，與質粒載體pGEM-T easy vector進行連接重組。
　　1.3重組質粒pGEM-T

3、 easy vector-lasR/lasI的驗證:重組質粒轉化感受態(tài)細菌DH5α，利用藍白斑實驗篩選出陽性克隆。擴增后提取pGEM-T easy vector-lasR/lasI質粒并進行pGEM-T easy vector-lasR/lasI Not I酶切鑒定和測序鑒定。
　　1.4利用軟件RNA structure5.2設計lasR和lasI基因mRNA反義寡核苷酸序列。
　　1.5反義寡核苷酸的篩選:進行l(wèi)asR/

4、lasI mRNA體外轉錄，利用斑點雜交實驗篩選出反義寡核苷酸序列。
　　2.銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設計與合成
　　依據(jù)篩選出的反義寡核苷酸序列，按照肽核酸設計原則設計合成銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸，并將其與穿膜肽(KFF)3K連接。
　　二、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸生物學作用研究
　　1.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1las

5、R和lasI基因表達的影響:利用qPCR方法檢測lasR和lasI基因mRNA相對表達量。
　　2.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1生長的影響:酶標儀測定LB液體培養(yǎng)基中銅綠假單胞菌PAO1OD600和LB固體培養(yǎng)基計數(shù)菌落。
　　3.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的影響:光學顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜內(nèi)細菌含量。
　　4.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1毒力因子表達的影響:采用ELIS

6、A技術檢測銅綠假單胞菌PAO1外毒素A、綠膿菌素含量的變化，qPCR方法檢測彈力蛋白酶lasB基因mRNA相對表達量。
　　結果：
　　一、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設計與篩選
　　1.成功構建lasR和lasI基因mRNA表達重組質粒pGEM-T easy vector-lasR/lasI，篩選出與銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因mRNA緊密結合的反義寡核苷酸序列。
　　2

7、.以篩選出的反義寡核苷酸序列為基礎合成反義肽核酸，并將其與穿膜肽結合構建了穿膜肽-肽核酸。
　　二、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸生物學作用研究
　　1.lasR/lasI穿膜肽-肽核酸抑制lasR/lasImRNA的表達，與對照組相比，其表達量有顯著差異，并且隨著穿膜肽-肽核酸濃度增加，對lasR/lasImRNA的表達抑制作用增強。
　　2.lasR/lasI穿膜肽-反義肽核酸濃度≧40μM時

8、，對銅綠假單胞菌PAO1的生長有明顯抑制作用，濃度越高，對生長的抑制作用越明顯。而穿膜肽和反義肽核酸本身對細菌的生長無明顯抑制作用。
　　3.光學顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，lasR/lasI穿膜肽-肽核酸轉染的銅綠假單胞菌PAO1，其生物被膜的形成明顯抑制。
　　4.lasR/lasI調控的毒力因子彈性蛋白酶lasB、綠膿菌素和外毒素A等在穿膜肽-肽核酸的作用下表達量均下降，與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計

9、學意義。
　　結論：
　　1.通過體外表達和斑點雜交實驗，成功效篩選出與目的基因lasR/lasI mRNA緊密結合的反義寡核苷酸序列，并在此基礎上成功設計合成反義肽核酸并構建了穿膜肽連接的穿膜肽-肽核酸。
　　2.穿膜肽-肽核酸明顯抑制lasR/lasI mRNA的表達，實現(xiàn)對銅綠假單胞菌las群體感應系統(tǒng)的淬滅。
　　3.lasR/lasI mRNA穿膜肽-肽核酸能夠顯著抑制銅綠假單胞菌PAO1生物被膜的形成