糖基化對β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性及構象的影響.pdf

1、糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式,對蛋白質的結構和功能有著重要影響。本文以課題組前期構建的三種不同糖基化類型表達系統(tǒng)(產紫青霉P.purpurogenum Li-3自然進化糖基化型、大腸桿菌無糖基化型和畢赤巴斯德酵母高甘露糖糖基化型)表達的β-D-葡萄糖醛酸苷酶為對象,對不同系統(tǒng)表達的β-D-葡萄糖醛酸苷酶進行分離純化；確定β-D-葡萄糖醛酸苷酶在不同表達系統(tǒng)中的糖基化水平；研究不同糖基化水平β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶學性質及催化

2、反應動力學；分析和計算糖基化后酶的構象穩(wěn)定性及熱力學參數,探討糖基化對β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性和結構的影響。主要研究結果如下:
　　 采用硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析、凝膠層析和親和層析等方法,分別純化了產紫青霉、重組大腸桿菌和重組畢赤巴斯德酵母表達的β-D-葡萄糖醛酸苷酶(分別稱為PGUS、PGUS-P和PGUS-E),獲得了三種β-D-葡萄糖醛酸苷酶的電泳級純品,HPLC檢測純度分別為92.1％、95.3％和98.3

3、％,其純度滿足后續(xù)糖基化與質譜分析的要求。
　　 采用MALDI-TOF MS測定PGUS、PGUS-E和PGUS-P的精確分子量分別為69.72 kDa、67.93 kDa和78.83 kDa。肽質量指紋圖譜結合串聯質譜對氨基酸序列鑒定表明,三種酶均和β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因pgus(EU095019)所編碼的氨基酸序列相對應。糖基化分析結果表明,PGUS-P為N-糖基化類型翻譯后修飾,其糖含量為14.42％,而PGUS和P

4、GUS-E無明顯糖基化修飾。酶學性質比較分析表明,三種β-D-葡萄糖醛酸苷酶最適pH、最適反應溫度、對底物對硝基苯-葡萄糖醛酸苷(PNPG)和甘草酸的催化反應動力學參數及催化水解甘草酸模式均有顯著差異。
　　 以純化后的PGUS-P為研究對象,用糖苷酶F(PNGase F)對其進行去糖基化,比較了PGUS-P去糖基化前后的酶學性質和反應動力學,表明PGUS-P去糖基化后,其最適反應溫度未明顯變化,但最適pH值范圍增大,對金屬離子

5、敏感性降低。去N-糖基化后的PGUS-P與底物PNPG和甘草酸的親和力均增強。
　　 比較了去糖基化前后PGUS-P的穩(wěn)定性及構象變化,表明去糖基化后的PGUS-P耐變性劑、有機溶劑及表面活性劑能力均下降,且更容易被胰蛋白酶水解。差示量熱掃描(DSC)研究表明,去糖基化的PGUS-P熱變性溫度Td和ΔH均下降,酶蛋白的熱穩(wěn)定性降低。熒光光譜和圓二色譜分析表明,去糖基化處理未改變PGUS-P酶蛋白的二級結構,但誘導了酶蛋白分子伸展