家蠅和日本沼蝦硫氰酸生成酶基因功能研究.pdf

1、家蠅(Musca domestica)屬于節(jié)肢動物門昆蟲綱雙翅目蠅科蠅屬,廣泛分布于陸地各處。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目長臂蝦科沼蝦屬,俗稱青蝦、河蝦,廣泛分布于中國、日本、東南亞和俄羅斯遠東地區(qū)的淡水河湖中。本文以陸生昆蟲家蠅和水生甲殼動物日本沼蝦為材料研究和比較其硫氰酸生成酶的功能。本研究共分以下4個部分:
　　(1)以本實驗室前期研究獲得的1條家蠅硫氰酸生成酶基因的

2、氨基酸序列作為query sequence,利用tBlastn程序在家蠅轉錄組和日本沼蝦轉錄組中查找其同源序列。隨后使用BlastX、SMART和ORF Finder程序對獲得的序列進行分析,最后確定了家蠅的5條序列和日本沼蝦的3條序列為硫氰酸生成酶樣基因,并命名為Md-Rho1-5和Mn-Rho1-3。使用CLC Main Workbench5軟件對獲得的序列和其他物種的硫氰酸生成酶、巰基丙酮酸硫轉移酶和HSP67B2基因的氨基酸序列

3、進行同源比對和進化樹構建,明確了硫氰酸生成酶之間的分子進化關系。
　　(2)成功構建了6種原核表達載體。獲得了4種可溶性表達的重組蛋白rMd-Rho1、rMd-Rho4、rMn-Rho1和rMn-Rho2,并且均具有硫氰酸生成酶活性。還獲得2種包涵體形式存在的重組蛋白rMd-Rho2和rMd-Rho3,經過變性復性過程之后,這2種重組蛋白也表現出了硫氰酸生成酶活性。
　　(3)利用GST pull down技術篩選了與硫氰酸

4、生成酶相互作用的蛋白質,結果顯示1條80 kD左右的差異條帶,但質譜鑒定未能明確是何種蛋白。
　　(4)利用實時熒光定量技術對Md-Rho3、Md-Rho4和Mn-Rho1、Mn-Rho2基因的表達模式進行研究。發(fā)現Md-Rho3、Mn-Rho1、Mn-Rho2基因在細菌刺激后上調表達,而Md-Rho2在刺激后下調表達。組織定量結果顯示Md-Rho3主要在家蠅血細胞中表達而Md-Rho4主要在家蠅腸道中表達,Mn-Rho1主要分布