鹽角草熱激蛋白90(SeHSP90)基因的克隆、表達(dá)及耐鹽性分析.pdf

1、鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一,土壤中高鹽度對(duì)許多高等植物都造成很大的傷害,嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)和發(fā)育,因此,分析植物對(duì)于鹽脅迫的反應(yīng)的生理及分子機(jī)制,對(duì)于耐鹽作物的培育,具有重要的實(shí)踐意義。研究表明,熱應(yīng)激蛋白(heatshockprotein,HSP)在對(duì)鹽度脅迫的耐受機(jī)制中起到了重要作用,而HSP90又是其家族的重要成員,并發(fā)現(xiàn)其在具有耐鹽作用的植物體內(nèi)含量豐富。鹽角草是最著名的耐鹽植物,其體內(nèi)是否含有HSP90基因和相對(duì)應(yīng)

2、的蛋白,HSP90基因表達(dá)的HSP90蛋白是否在其鹽脅迫耐受中起到作用,本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。
　　通過(guò)簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度為1142bp的鹽角草SeHSP90基因的中間片段,利用RACE技術(shù)首次從鹽角草中獲得SeHSP90(GenBank:KC181862)基因的全長(zhǎng)cDNA序列,大小為2461bp,開(kāi)放閱讀框2091bp,編碼697個(gè)氨基酸,分子量約為79kD。
　　通過(guò)生物信息學(xué)定位分析表明SeHSP90蛋白在細(xì)胞

3、質(zhì)內(nèi)合成后不再進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),最終定位于細(xì)胞質(zhì)中,且具有HSP蛋白家族特征序列;理化性質(zhì)分析表明SeHSP90為親水性蛋白,等電點(diǎn)為5.01,主要存在有三種的磷酸化氨基酸,不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列;同源性分析表明,SeHSP90與不同物種的HSP90氨基酸序列間存在多個(gè)高度保守區(qū)域,且與黃燈籠辣椒親緣關(guān)系最近。
　　通過(guò)雙酶切技術(shù)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-SeHSP90并成功轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)。然后利用SDS-PAG

4、E蛋白電泳檢測(cè),表達(dá)蛋白條帶大小與預(yù)期一致,說(shuō)明SeHSP90基因可以在BL21(DE3)中獲得表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行IPTG濃度優(yōu)化,表明轉(zhuǎn)入SeHSP90基因的菌株的最適IPTG濃度為0.025mmol/L。
　　通過(guò)不同鹽濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組菌(pET-SeHSP90)的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照菌,并且生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)隨鹽度提高而更為顯著,鹽濃度為5％時(shí),重組菌的生長(zhǎng)約為對(duì)照菌的1.5倍,6%時(shí)約為1.7倍,6.5%時(shí)約為2.5倍,7%時(shí)約為3倍