T4溶菌酶基因的遺傳轉化及作為選擇標記基因的研究.pdf

1、T4溶菌酶是目前發(fā)現(xiàn)活性最高的溶菌酶,可以同時裂解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，還可以通過一種非酶機制使病毒失活，抑制真菌游動孢子、分生孢子的萌發(fā)和菌絲的伸長，是一種高效的廣譜抗菌劑。本研究克隆得到T4溶菌酶基因全長，并成功地將T4溶菌酶基因插入到表達載體pCambia1304中，得到含目的基因的表達載體pCT4。
　　本研究首先建立了泡桐C125葉片的高效再生和農桿菌GV3101介導的遺傳轉化體系。所建立的再生體系中最佳的芽分化誘

2、導培養(yǎng)基為：MS+12mg/L6-BA+0.6 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為：MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.15 mg/L IBA。最佳的遺傳轉化體系為：農桿菌濃度為OD600=0.2，侵染時間為3min，暗培養(yǎng)4天，最適脫菌劑Cef濃度為600mg/L，葉片對Hyg適宜的選擇壓力濃度為8mg/L。
　　本研究以根癌農桿菌GV3101介導表達載體pCT4轉化泡桐C125葉片，對經(jīng)過篩選后的再生植株

3、進行PCR擴增試驗和GUS組織活性檢測，得到了3株轉基因植株，轉化率為20％。以所得3株轉基因植株無性系為砧木，泡桐叢枝病苗為接穗進行了嫁接轉染實驗，經(jīng)過一個月培養(yǎng)后，觀察到不同抗性程度和不同表型的嫁接苗。對嫁接苗進行植原體16SrRNA基因保守序列片段的PCR擴增試驗，都檢測到1.5kb大小的特異性條帶，證明3個轉基因植株無性系都嫁接成功。
　　本研究以根癌農桿菌GV3101介導表達載體pCT4和陽性對照表達載體pCambia1

4、304轉化煙草、楊樹和紅豆杉愈傷組織TM3，轉化和再生過程中均不使用抑制農桿菌的氨芐青霉素和篩選抗生素潮霉素B，結果表明：3個轉化試驗中陽性對照葉片或愈傷組織由于農桿菌的抑制作用，最后都黃化、褐化甚至死亡；3個轉化試驗中實驗組（表達載體pCT4）的葉片在長滿農桿菌的情況下都分化出再生芽，紅豆杉愈傷組織TM3存在一定程度上的褐化現(xiàn)象，但與陽性對照相比較輕微。進一步將轉化T4溶菌酶基因的煙草試驗組分化的再生植株提取DNA，進行PCR擴增試驗