玉米GSAT突變體作為篩選標記的植物表達載體構建.pdf

1、耐抗生素和除草劑的篩選標記基因在植物基因組和葉綠體遺傳轉化過程中起著至關重要的作用。但因其存在的潛在生態(tài)安全和對人類健康的危害等問題,對于標記基因的應用一直頗受爭議。近年來,對轉基因是否安全等問題的討論一直爭論不休,加上政府監(jiān)管要求更加嚴格,迫切的需求一種安全的替代選擇系統(tǒng)。已發(fā)現,細菌四吡咯分子合成的關鍵酶谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶(glutamate-1-semialdehydeaminotransferase,GSAT)的突變體耐

2、專一性抑制劑3-氨基-2,3-二氫苯甲酸(Gabaculine)。它可以作為植物基因組轉化的安全篩選標記基因。為此,我們嘗試以玉米GSAT作為植物核基因組和葉綠體基因組篩選標記,構建相關載體,獲得以下主要結果:
　　1.根據本實驗室已構建好的玉米GSAT突變體基因(mGSATM),設計引物,PCR擴增,將擴增片段酶切,插入pCAMBIA1301,取代GUS基因,構建核遺傳轉化表達載體。
　　2.采用前人改進的高離子濃度低pH

3、法,提取獲得了煙草葉綠體基因組DNA,電泳檢測表明葉綠體基因組DNA符合要求,設計引物,擴增葉綠體同源重組片段trnA和trnI,測序結果表明和公布的序列同源性達99％。
　　3.利用重疊PCR技術,分別在葉綠體常用篩選標記壯觀霉素抗性基因aadA和本實驗安全篩選標記基因mGSATM前插入葉綠體來源的啟動子prrn,并將葉綠體來源的終止子psbA加在mGSATM基因后面。然后將葉綠體同源重組片段trnA、trnI分別插入兩端,構建