肝細胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)LncRNAs篩選及其作用機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，特別是在亞洲、非洲，肝癌發(fā)病率明顯高于其它地區(qū)，并且肝癌致死率在我國惡性腫瘤中高居第二位;而肝癌中，肝細胞癌(HCC)大約占80％。因此探究肝細胞癌相關(guān)的癌基因或抑癌基因，研究肝細胞癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制對肝細胞癌的預防、診斷和治療等均具有重要的實際意義。目前臨床手術(shù)切除或者肝移植仍是治療肝細胞癌最有效的治療方法，但是一方面由于肝癌發(fā)病速度快，惡性程度高，多數(shù)患者在肝癌早期并沒有明顯的臨床癥狀，大多

2、數(shù)病人確診時已屬于肝癌晚期，錯過了手術(shù)治療的最佳時機，限制了手術(shù)治療手段的應用;另一方面肝細胞癌易擴散轉(zhuǎn)移、術(shù)后易復發(fā)，導致肝細胞癌患者的術(shù)后生存期較短，影響手術(shù)治療的效果。和其他惡性腫瘤相同，肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多基因參與、多步驟的、復雜的生物學過程，其中涉及到了許多基因的改變、腫瘤微環(huán)境等因素導致了肝實質(zhì)細胞的的惡性轉(zhuǎn)化。雖然，目前全世界已經(jīng)嘗試用高通量技術(shù)篩選技術(shù)對肝細胞癌的功能基因的突變譜及差異表達譜進行了研究，但目

3、前臨床上沒有很好的診斷標志分子及治療靶標。之前的大部分研究一直是以蛋白質(zhì)編碼基因為研究對象，隨著非編碼RNA研究的逐漸深入及高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，近十年來，人們發(fā)現(xiàn)基因組可以編碼大量長片段的非編碼RNA，它們在生命活動及疾病發(fā)生中的作用也逐漸得到揭示。目前為止，在肝細胞癌中仍沒有篩選到可以用于臨床的診斷或預后的lncRNA分子。因此本研究采用基因表達譜芯片高通量技術(shù)并輔以生物信息學分析及實驗技術(shù)篩選、驗證與肝細胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的長

4、鏈非編碼RNA(lncRNA)，并探討其可能的臨床意義。
　　本文第一章，我們通過采用博奧生物集團有限公司的人類長鏈非編碼RNA芯片對3對已經(jīng)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織與癌旁組織及3對未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA的差異表達譜進行篩選，得到與肝細胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的長鏈非編碼RNA。在轉(zhuǎn)移組肝癌樣本中，我們發(fā)現(xiàn)179個lncRNA上調(diào)（例如HOXD-AS1和GOLGA2P10），76個lncRNA下調(diào)(例如HOTAIR)。然后

5、我們對篩選得到的顯著差異lncRNA在44例(20例未發(fā)生轉(zhuǎn)移，24例發(fā)生轉(zhuǎn)移)肝細胞癌組織及癌旁組織中進行驗證。我們篩選到的一條具有較好臨床意義的假基因編碼的GOLGA2P10 Transcript1，其具有良好的臨床相關(guān)性，并且TCGA中361例肝細胞癌病人的臨床數(shù)據(jù)顯示其可以作為HCC預后的候選標志分子(p=0.00512)。
　　第二章，我們著重探討GOLGA2P10在肝癌細胞中的的生物學功能和分子機制。我們通過細胞功能實

6、驗證實GOLGA2P10可以促進SMMC-7721、L02細胞增殖與遷移，但在HepG2細胞中未發(fā)現(xiàn)該促進效應。為了進一步闡明GOLGA2P10的分子機制，我們分析了GOLGA2P10的細胞定位和下游信號通路。我們首先運用RT-PCR及FISH技術(shù)對GOLGA2P10在細胞內(nèi)的定位分布進行研究，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細胞核中;然后我們運用表達譜芯片篩選GOLGA2P10影響的下游基因及信號通路，并運用生物信息學方法對篩選得到的差異基因進行GO

7、分析、IPA分析，最后結(jié)合細胞生物學及分子生物學實驗證明了GOLGA2P10可以上調(diào)FZD3、FZD6，激活Wnt信號通路，進而引起級聯(lián)反應:上調(diào)MMP7促進細胞遷移;上調(diào)c-Myc，及其下游靶基因GLS1引起細胞代謝改變（脂代謝、谷氨酰胺代謝），增強SMMC-7721細胞在應激狀態(tài)下的能量供應，促進細胞生存、增殖及遷移，而在細胞系HepG2中（HepG2中CTNNB1發(fā)生突變，缺少調(diào)控其降解的Ser/Thr結(jié)構(gòu)域，因此不受上游信號調(diào)控

8、），則不能激活Wnt信號通路，從側(cè)面證明了我們的結(jié)論。因此GOLGA2P10可能是部分HCC病人的潛在治療靶標。根據(jù)已有的RNA pulldown-質(zhì)譜實驗結(jié)果與結(jié)合在FZDs的啟動子、增強子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)進行比對，我們推測GOLGA2P10應該是通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CTBP1介導增強子與啟動子之間的相互作用促進FZD3、FZD6表達，但仍然需要RIP、CHIP及IP實驗驗證。
　　第三章是研究HOXD-AS1促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移的作用

9、機制，本課題組之前的一項研究證實HOXD-AS1在肝細胞癌中異常高表達，細胞功能實驗證明其可以顯著增強肝癌細胞系的遷移能力，我們對其具體機制進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)HOXD-AS1在細胞質(zhì)與細胞核中均有分布，其可以通過多種機制參與肝細胞癌的轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果證明HOXD-AS1可以競爭性結(jié)合miR-19a促進ARHGAP11A上調(diào)表達，促進肝癌細胞遷移。熒光定量PCR實驗證實miRNA-19a在肝細胞癌組織樣本中下調(diào)表達，ARHGAP11A