miR-493-STMN1通路介導腎小管上皮細胞G2-M期阻滯促進腎間質纖維化的機制.pdf

1、腎間質纖維化是多種慢性腎臟病(Chronic kidney diseases，CKD)進展至終末期腎?。‥nd stage renal disease,ESRD）的共同病理改變，一旦進入ESRD，患者將面臨昂貴的腎臟替代治療費用，生活質量的顯著降低和生存時間縮短等嚴峻問題。因此，找到新的抗纖維化治療方法至關重要。慢性缺氧不僅是各種慢性腎臟病進展至終末期的共同通路，更重要的是它是腎小管間質損傷最重要的始動因素。近期研究表明，小管上皮細胞

2、G2/M期阻滯，能夠通過激活成纖維細胞并促進轉錄生長因子（Transcriptional growth factor–β1，TGF-β1）、結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF），Ⅳ型膠原α1（Collagen4A1，COL4A1）及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的分泌，導致腎臟纖維化，那么，在缺氧微環(huán)境下，腎小管上皮細胞是否也發(fā)生細胞周

3、期阻滯進而促進纖維化呢？以及調控這一過程的具體分子機制是什么？都是亟待回答的問題。
　　MiRNAs（microRNAs，miRNAs)是一類內源性的非編碼核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA），它能夠通過抑制靶基因的轉錄和翻譯或者促進靶基因的降解調節(jié)基因表達，與腎間質纖維化關系密切。近年來，研究表明：缺氧能夠誘導大量miRNAs的表達并產生相應的功能。除此之外，一些研究也證明了有些 miRNAs參與細胞周期的調控。

4、我們前期通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-493在缺氧的HK2細胞中高表達，進一步在單側輸尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）模型及IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）患者組織中也驗證了miR-493呈高表達。進一步，通過生物信息學預測分析發(fā)現(xiàn)，STMN13'-非翻譯區(qū)（3'-Untranslated region，3'-UTR）存在miR-493的潛在結合位點，而且它們的表達呈

5、負相關。STMN1是細胞周期的調控子，能夠編碼stathmin1蛋白，通過調節(jié)微管的穩(wěn)定性在有絲分裂紡錘體形成中發(fā)揮著關鍵的作用，即STMN1能夠參與細胞周期的調控。由此我們推測，缺氧微環(huán)境下，miR-493可能通過抑制 STMN1介導了腎小管細胞周期G2/M期阻滯進而促進了腎間質纖維化，本研究將通過體內外實驗證實這一推論。
　　目的：
　　1)研究慢性缺氧在腎小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化中的作用。
　　2

6、)研究miR-493在慢性缺氧誘導的腎小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化中的作用。
　　3)缺氧微環(huán)境下miR-493-STMN1通路在小管細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化中的調控作用。
　　4)體內抑制miR-493的表達，驗證其逆轉腎間質纖維化的作用。
　　方法：
　　1)通過流式細胞術、Western Blot及免疫組化檢測缺氧微環(huán)境下細胞周期改變及腎間質纖維化指標。
　　2)通過qRT-PCR

7、及原位雜交技術檢測缺氧微環(huán)境下miR-493的表達，然后在HK2細胞中轉染miR-493模擬物（mimic）及抑制物（inhibitor），通過流式細胞術及Western Blot法檢測細胞周期改變及腎間質纖維化指標。
　　3)通過熒光素報告基因、Western Blot及qRT-PCR驗證miR-493對STMN1的調控作用及機制。然后，在HK2細胞中轉染STMN1-shRNA體外抑制STMN1的表達，通過流式細胞術及Weste

8、rn Blot法檢測細胞周期改變及腎間質纖維化指標。
　　4)小鼠體內注射miR-493 spongeAAV，通過qRT-PCR、免疫組化及Western Blot法驗證下調miR-493后對腎間質纖維化的逆轉作用。
　　結果：
　　1)慢性缺氧能夠介導小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化。
　　首先通過流式細胞術檢測缺氧處理的HK2細胞周期變化，發(fā)現(xiàn)G2/M期比例增加，進一步通過Western Blot法檢

9、測缺氧處理的HK2細胞及UUO模型發(fā)現(xiàn)：G2/M期標志（cyclinB1/cyclinD1）隨缺氧及梗阻時間的延長表達增加，同時纖維化相關因子CTGF、COL4A1及α-SMA的表達增加。在UUO模型中，免疫組化結果顯示：G2/M期標志（PH3/Ki67）在UUO14d后升高，并且Masson染色顯示腎間質纖維化程度增加，表明缺氧微環(huán)境能夠介導小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化。
　　2)在缺氧微環(huán)境下miR-493高表達，

10、并且能夠誘導小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化。
　　我們通過qRT-PCR檢測缺氧處理的HK2細胞及IgAN患者組織中miR-493的表達，結果顯示：與對照組比較，miR-493高表達，且原位雜交術也顯示miR-493在UUO14d后表達增加。然后，在HK2細胞中轉染miR-493mimic及inhibitor，通過流式細胞術及Western Blot發(fā)現(xiàn)：miR-493mimic能夠增加小管細胞G2/M期比例且促進纖維化

11、相關因子的表達，相反，miR-493 inhibitor能夠逆轉這一改變。
　　3)miR-493在轉錄后水平抑制STMN1的翻譯，介導小管上皮細胞G2/M期阻滯及腎間質纖維化。
　　首先，生物信息預測發(fā)現(xiàn)STMN1是miR-493的靶基因，進一步通過熒光素報告基因驗證了miR-493能夠直接調控STMN1。隨后，通過轉染miR-493mimic檢測STMN1的mRNA及蛋白水平發(fā)現(xiàn)：miR-493在轉錄后水平抑制STMN1

12、的翻譯調控STMN1的表達。最后，在UUO模型中檢測STMN1的表達發(fā)現(xiàn)：隨梗阻時間增加表達降低；免疫組化及Masson結果顯示：UUO14d后，STMN1表達降低同時間質纖維化程度增加。體外轉染STMN1 shRNA抑制STMN1的表達發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，轉染STMN1 shRNA后，G2/M期標志（cyclinB1/cyclinD1）表達增加，同時纖維化相關因子CTGF，COL4A1及α-SMA的表達增加。
　　4)體內干預m

13、iR-493的表達能夠抑制腎間質纖維化。
　　在小鼠體內，通過注射miR-493 sponge腺相關病毒(Aeno-associated virus,AAV)抑制miR-493的表達，結果顯示：與對照組比較，miR-493 sponge AAV能夠降低纖維化相關分子α-SMA及COL4A1的表達，增加STMN1的表達，提示干預miR-493的表達能夠抑制腎間質纖維化。
　　結論：綜上所述，我們研究表明miR-493在缺氧微環(huán)