SOCS3在心肌細胞缺氧復氧中的作用及調(diào)控機制.pdf

1、缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是一種常見的危害人類健康的疾病，僅2012年一年死亡人數(shù)就達740萬。并且，IHD耗費醫(yī)療資源驚人，通過溶栓、PCI等治療手段盡快恢復冠狀動脈血流供應是挽救患者生命的關(guān)鍵，但研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血持續(xù)一段時間后，重新恢復血流灌注會給心臟組織帶來新的損傷，出現(xiàn)心肌頓抑、心功能降低及惡性心律失常發(fā)作等繼發(fā)性心肌損害——缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion in

2、jury, IRI)。研究心臟缺血再灌注損傷的發(fā)生機制，探討有效的IRI心肌保護措施長期以來都是心血管病醫(yī)生孜孜以求的夢想。目前認為，心臟缺血再灌注損傷與心肌線粒體能量代謝障礙、細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基釋放和細胞凋亡等有關(guān)。
　　細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族是特征性SOCS盒胞漿蛋白分子家族，包括SH2核心結(jié)構(gòu)及具有保守性的C端40個氨基酸模塊。該家族存

3、在多種細胞內(nèi)并可被誘導表達。目前發(fā)現(xiàn)該家族有CIS(the cytokine-inducible SH2 domain-containing protein)、SOCS1-7等8個成員分子。SOCS通過競爭結(jié)合JAK催化位點從而抑制JAK信號通路。其中SOCS1與SOCS3同源性最強，與心血管疾病關(guān)系最為密切。既往研究發(fā)現(xiàn)SOCS1競爭心肌營養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)下游信號通路JAK的催化位點,從而抑制JAK

4、-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路，導致心肌細胞凋亡增加及心肌梗死面積擴大。
　　MicroRNA(miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約為18～25個核苷酸的小RNA，通過對靶mRNA降解或者翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對靶基因負調(diào)控作用。參與細胞內(nèi)多種重要調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚及重塑、心律失常、心力衰竭及心肌細胞凋亡等病理生理過程。在心肌成纖維細胞中， miR-19a通過調(diào)控TGF-βR II抑制自噬。又有報道m(xù)iR-1

5、9與心肌細胞凋亡有關(guān)；最近研究發(fā)現(xiàn) miR-19b在心臟缺血再灌注損傷中通過調(diào)控PTEN抑制心肌細胞凋亡。鑒于miR-19a與miR-19b同源于miR-17-92基因簇，miR-19a極有可能參與心臟缺血再灌注損傷。最近又有研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞中miR-19a靶向抑制SOCS3表達增加JAK-STAT的轉(zhuǎn)錄并促進肝細胞增殖。由此我們推測，在缺血再灌注損傷過程中，miR-19a可能通過靶向調(diào)控SOCS3抑制心肌細胞凋亡。
　　綜上所

6、述，我們推測在心肌IRI過程中可能存在的一個調(diào)控過程：心肌IRI時保護性細胞因子（比如CT-1等)表達上調(diào)，誘導JAK-STAT3活性增強,導致STAT3磷酸化活性增強可以上調(diào)SOCS3表達，SOCS3反過來競爭結(jié)合JAK并抑制其表達，抵消一部分STAT3對心肌細胞抗凋亡作用。如果miR-19a能抑制SOCS3的表達，間接提高JAK-STAT3的活性并增強在IRI中的抗凋亡作用。
　　為了證實這一推測。本研究進行一下三方面的探索：

7、
　　首先，通過離體實驗探討SOCS3在缺血再灌注損傷中的促凋亡作用，將建立心肌細胞缺氧復氧模型，通過細胞存活率檢查、生化檢測等體外實驗證實SOCS3與促凋亡蛋白Bim之間的關(guān)系。
　　其次，在離體實驗探討miR-19a對SOCS3靶向調(diào)控作用機制。通過miR-19a過表達及抑制實驗檢測SOCS3的蛋白表達以及對心肌細胞凋亡的影響。
　　第三，為探討SOCS-3與急性心肌梗死具有相關(guān)性，以急性心肌梗死患者作為研究對象，

8、分析高表達SOCS3是否可以預測心臟主要不良事件。
　　第一部分探討在心肌細胞缺氧復氧過程中SOCS3與Bim之間的關(guān)系及對細胞凋亡的影響
　　目的：建立H9c2心肌細胞缺氧復氧模型，明確SOCS3在心肌細胞缺氧復氧中對Bim表達影響及細胞凋亡的影響。
　　方法：
　　1）培養(yǎng)H9c2心肌細胞。
　　2）模擬缺血再灌注損傷建立缺氧復氧（Hypoxia reoxygenation，HR）模型， Western

9、-blot檢測SOCS3表達。
　　3）設(shè)計與合成3對靶向SOCS3基因的siRNA(SOCS3-siRNA)，Western-blot篩選最佳SOCS3-siRNA。
　　4）將效果最佳SOCS3-siRNA轉(zhuǎn)染H9c2，給予缺氧復氧。實驗分4組：
　　空白對照組（Control組）、HR組、HR+Negative Control組、HR+SOCS3-siRNA組；
　　5）用CCK8法檢測細胞增殖活力，F(xiàn)lo

10、w cytometry檢測細胞凋亡率，Western-blot技術(shù)分別測定SOCS3、凋亡相關(guān)基因Bim、Bax和Bcl-2凋亡蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1）缺氧復氧模過程中SOCS3表達明顯上調(diào)。
　　2）與空白對照組相比，HR組細胞存活率明顯減少（P＜0.05），SOCS3-siRNA組H9c2存活率明顯增加（P＜0.05），凋亡率明顯下降（P＜0.05）；
　　3）與HR組相比，SOCS3-siRNA+

11、HR組Bim表達下調(diào)（P＜0.01）；
　　4）與HR組相比，SOCS3-siRNA+HR組，Bcl-2表達上調(diào)，Bax表達下調(diào)， Bcl-2/Bax比值增大（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1）H9c2心肌細胞在缺氧復氧后，SOCS3表達明顯升高；
　　2）在心肌細胞缺氧復氧模型中，沉默SOCS3可以下調(diào)Bim和Bax的表達；
　　3）在心肌細胞在缺氧復氧模型中，沉默SOCS3可以上調(diào)Bcl-2的表達
　　4

12、）在心肌細胞在缺氧復氧模型中，沉默SOCS3可以升高細胞活力，減少細胞凋亡。
　　第二部分：缺氧復氧心肌細胞中SOCS3對JAK-STAT3信號通路的影響及miR-19a對其調(diào)控作用
　　目的：本研究擬建立H9c2心肌細胞HR模型，測定miR-19a在HR過程中表達，在H9c2中轉(zhuǎn)染miR-19a mimics或miR-19a inhibitor調(diào)控miR-19a的表達，測定細胞SOCS3的表達及細胞凋亡率、凋亡相關(guān)基因蛋白

13、表達水平，探討miR-19a在心肌細胞缺氧復氧中對SOCS3調(diào)控作用及介導HR細胞凋亡的影響。方法：
　　1）模擬缺血再灌注損傷建立HR模型，qRT-PCR檢測miR-19a表達。
　　2）使用Lipofectamine3000分別將miR-19a mimics及miR-19a inhibitor轉(zhuǎn)染入H9c2細胞，給予缺氧復氧。
　　3）實驗分6組：
　　空白對照組（Control組）、HR、HR+mimics

14、 Negative Control、HR+miR-19a mimics組、HR+MircoRNA inhibitor Negative Control組、HR+miR-19a inhibitor組；
　　4） CCK8檢測細胞活力，F(xiàn)low cytometry檢測細胞凋亡率，Western-blot技術(shù)分別測定SOCS3、p-STAT3、STAT3、Caspases、Bim、Bax和Bcl-2的表達。結(jié)果：
　　1）HR過程

15、中miR-19a表達明顯下調(diào)。
　　2）HR組較control組細胞存活率明顯減少（P＜0.05），miR-19a mimics組H9c2細胞存活率明顯增加（P＜0.05），凋亡率明顯下降（P＜0.05）；miR-19a inhibitor組H9c2細胞存活率明顯下降（P＜0.05），凋亡率明顯增加（P＜0.05）；
　　3）過表達miR-19a明顯抑制SOCS3、Caspases、Bim及Bax蛋白表達，上調(diào)p-STAT3

16、活性及Bcl-2蛋白，抑制細胞凋亡。
　　4）抑制miR-19a明顯上調(diào)SOCS3、Caspases、Bim及Bax蛋白表達，抑制p-STAT3活性，Bcl-2表達下調(diào)，促進凋亡。
　　結(jié)論：1）H9c2心肌細胞缺氧復氧后，miR-19a表達明顯下調(diào)；
　　2）心肌細胞缺氧復氧過程中，miR-19a可能通過調(diào)控SOCS3發(fā)揮抗凋亡作用；
　　第三部分血漿SOCS-3上調(diào)與急性心肌梗死不良預后相關(guān)性分析
　　

17、目的：人血漿SOCS-3上調(diào)與急性心肌梗死不良預后相關(guān)性分析
　　方法：入選2016.3-2016.10在我院就診急性心肌梗死（AMI）患者（n=68），
　　同期選擇年齡、性別等相匹配的，無心血管系統(tǒng)疾病的自愿者作為健康對照組（n=20）。采用酶聯(lián)免疫（ELISA）測定SOCS3、cTnI和CK-MB。并將SOCS3與cTnI、CK-MB、NT-proBNP、eGFR、左室射血分數(shù)(left ventricular eje

18、ction fraction LVEF)、冠狀動脈病變血管數(shù)、 Killip心功能分級和主要不良心血管事件（MACE）等行相關(guān)分析。
　　結(jié)果：AMI患者血漿SOCS-3表達水平顯著高于健康對照組（P＜0.01)；通過ROC曲線比較，血漿SOCS-3區(qū)分AMI患者的敏感性和特異性分別為70.0和85.5(AUC=0.856)。SOCS-3水平與高血壓(P=0.002),左心室射血分數(shù)(LVEF)(P=0.004), eGFR(P＜

19、0.001),cTnI(P＜0.001), CK-MB(P＜0.001), NT-proBNP(P＜0.001)等臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)。此外,AMI患者冠狀動脈狹窄數(shù)目越多，血漿SOCS-3水平越高。SOCS-3水平與Killip心功能分級相關(guān)，Killip心功能分級越高的患者血漿SOCS-3水平越高。 AMI患者中，根據(jù)兩分位中位數(shù)，高血漿SOCS-3比低血漿SOCS-3患者具有更高主要不良心血管事件（MACE）發(fā)生率(P＜0.01)