先天性甲減伴甲狀腺腫大患兒DUOX1突變篩查及DUOX1-DUOXA1突變致病機理研究.pdf

1、目的：研究中國山東地區(qū)先天性甲狀腺功能減退癥（Congenital hypothyroidism, CH）伴甲狀腺腫大患兒雙氧化酶1（DUOX1）基因突變的類型及特點，并對突變CH患兒的臨床表型進行確認，建立基因型與表型的關系。對本次研究發(fā)現(xiàn)的DUOX1基因突變及前期工作中發(fā)現(xiàn)的雙氧化酶成熟因子1（DUOXA1）基因突變進行功能學研究，從而闡明DUOX1/DUOXA1基因突變導致CH的致病機理。
　　方法：選取43例甲狀腺腫大的C

2、H患兒及100例正常對照新生兒作為研究對象，提取其外周血基因組DNA，采用PCR及一代測序的方法，對DUOX1基因全部外顯子進行突變篩查。對本次研究發(fā)現(xiàn)的DUOX1基因突變（c.3910G>A, p.R1307Q）及前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1基因突變（c.166C>T, p.R56W）進行功能學研究。首先，構建DUOX1、DUOXA1野生型及突變型真核表達載體，提取質粒并轉染Hela細胞。利用q-PCR及Western-blot技術從

3、mRNA及蛋白水平上檢測DUOX1/DUOXA1基因突變對DUOX1基因mRNA及蛋白表達的影響。其次，利用多功能酶標儀檢測重組質粒轉染Hela細胞48h后過氧化氫（H2O2）的生成量，判斷DUOX1/DUOXA1基因突變對DUOX1酶活性的影響。最后，重組質粒轉染Hela細胞24h后加入放線菌酮（Cycloheximide, CHX），CHX加入后的24h內選取4個時間點分別檢測細胞內DUOX1蛋白的含量，計算DUOX1蛋白的降解速率

4、來判斷DUOX1基因突變對其蛋白穩(wěn)定性的影響。
　　結果：在43例伴甲狀腺腫大的CH患兒中，發(fā)現(xiàn)1例患兒帶有DUOX1雜合錯義突變（c.3910G>A, p.R1307Q），且攜帶該突變的患兒表現(xiàn)為輕度的暫時性甲低。前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1雜合錯義突變（c.166C>T, p.R56W），攜帶該突變的患兒表現(xiàn)為永久性甲低。功能學研究表明，DUOX1基因突變并未改變DUOX1蛋白的穩(wěn)定性，但DUOX1/DUOXA1基因突變均導致

5、DUOX1蛋白表達量減少，DUOX1酶活性下降。此外，與同時轉染野生型DUOX1/DUOXA1質粒的Hela細胞相比，轉染突變型DUOXA1質粒或同時轉染突變型DUOX1/DUOXA1質粒的Hela細胞，產生H2O2的能力顯著下降，證實DUOXA1在DUOX1催化合成H2O2的過程中起到輔助作用。
　　結論：43例甲狀腺腫大的CH患兒中有1例患兒帶有DUOX1基因雜合錯義突變（c.3910G>A, p.R1307Q），但DUOX1

6、基因突變率低，可能不是中國山東地區(qū)CH伴甲狀腺腫大患兒發(fā)病的主要因素。對該突變及前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1基因雜合錯義突變進行功能學研究，研究表明DUOX1/DUOXA1基因突變均造成H2O2生成能力部分喪失，甲狀腺激素合成不足，促甲狀腺激素反饋性增加，刺激甲狀腺濾泡上皮細胞，臨床上表現(xiàn)為先天性甲減伴甲狀腺腫大，且DUOXA1在DUOX1催化合成H2O2的過程中起到輔助作用。此外，攜帶DUOX1基因雜合錯義突變的CH患兒臨床表現(xiàn)為暫時