GAS5在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率較高。目前，手術(shù)聯(lián)合放、化療的綜合治療方式對(duì)宮頸癌的治療有顯著效果，80％的患者對(duì)鉑/紫杉醇類(lèi)化療藥物敏感，但不少患者在治療后一段時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。長(zhǎng)期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌患者的5年生存率高達(dá)90%以上，而晚期宮頸癌患者的5年生存率則徘徊在10%-30%。因此，宮頸癌診斷方法的完善及耐藥機(jī)制的明確顯得尤為重要。目前臨床存在的宮頸病變患

2、者診斷指標(biāo)，能指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)患者分期判斷，但是沒(méi)有診斷患者病情的發(fā)展及預(yù)測(cè)耐藥程度的指標(biāo)。因此尋找評(píng)估患者發(fā)展程度及耐藥能力的分子學(xué)標(biāo)志物，探索宮頸癌耐藥的分子學(xué)機(jī)制以獲取有效的治療靶點(diǎn)是改善宮頸癌患者預(yù)后的重要研究課題。
　　繼miRNA的大量研究后，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LongnoncodingRNA，LncRNA）在腫瘤中發(fā)揮的作用已引起極大關(guān)注。生長(zhǎng)組織特異轉(zhuǎn)錄本5（Growtharrestedsp

3、ecific5，GAS5）是與腫瘤生長(zhǎng)及預(yù)后密切相關(guān)的LncRNA，該基因的異常低表達(dá)與肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌等其他眾多人類(lèi)實(shí)體腫瘤的進(jìn)展也有密切關(guān)系，扮演抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的角色。此外，在一項(xiàng)關(guān)于GAS5對(duì)與乳腺癌細(xì)胞促凋亡因素反應(yīng)的調(diào)控實(shí)驗(yàn)提示了，GAS5的過(guò)表達(dá)能過(guò)促進(jìn)多西他賽、5氟尿嘧啶等化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于GAS5與宮頸癌的研究甚少，GAS5是否異常表達(dá)于宮頸癌組織、是否影響了

4、宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及耐藥性、是否扮演了抑癌基因的角色及其作用機(jī)制如何等眾多問(wèn)題尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。
　　第一部分GAS5在宮頸癌中的表達(dá)及對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　研究目的:
　　1、探討GAS5在宮頸癌組織的表達(dá)程度，分析其表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系；
　　2、細(xì)胞水平驗(yàn)證GAS5對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa及CaSki增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；
　　3、動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證GAS5表達(dá)

5、水平與宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　研究方法:
　　1、取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科40例宮頸癌術(shù)后患者的癌與癌旁組織，結(jié)合組織類(lèi)型、組織分化程度及患者FIGO分期分析GAS5的表達(dá)與各指標(biāo)的關(guān)系。
　　2、構(gòu)建GAS5過(guò)表達(dá)慢病毒載體，分別感染宮頸癌細(xì)胞株，得GAS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株HeLa、SiHa與CaSki；設(shè)計(jì)GAS5-siRNA以抑制HeLa、SiHa與CaSki細(xì)胞GAS5的表達(dá)。
　　3、生物學(xué)功能

6、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)或siRNA抑制改變GAS5表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。
　　1）CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的改變；
　　2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)GAS5后細(xì)胞周期及凋亡的情況；
　　3）Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變；
　　4、構(gòu)建宮頸癌SiHa細(xì)胞裸鼠成瘤模型，觀(guān)察GAS5穩(wěn)轉(zhuǎn)株與NC組生長(zhǎng)在動(dòng)物體內(nèi)的差別。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS

7、19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以??±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法和Student’st檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、GAS5的表達(dá)在宮頸癌組織中較癌旁組織要低，且降低程度與分化程度呈正比相關(guān)、與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)。
　　2、GAS5慢病毒載體感染后有效提高GAS5表達(dá)量，GAS5-siRNA能有效抑

8、制GAS5表達(dá)。
　　3、CCK8結(jié)果提示過(guò)表達(dá)GAS5有效下調(diào)宮頸癌細(xì)胞株細(xì)胞的生長(zhǎng)速度；而siRNA下調(diào)GAS5表達(dá)后細(xì)胞的增殖速度上調(diào)。
　　4、取GAS5穩(wěn)定表達(dá)的SiHa細(xì)胞進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，相對(duì)于對(duì)照組而言，細(xì)胞的凋亡率上升且細(xì)胞大部分停留在G0/G1期。
　　5、過(guò)表達(dá)GAS5能夠降低HeLa、SiHa及CaSki細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而抑制GAS5能夠增強(qiáng)HeLa、SiHa及CaSki細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

9、
　　6、GAS5能夠上調(diào)SiHa細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、GAS5在宮頸癌中低表達(dá)，且GAS5水平與宮頸癌分期及組織類(lèi)型有相關(guān)性，或許能作為臨床診斷或治療指標(biāo)。
　　2、作為抑癌基因，GAS5能夠在細(xì)胞水平上抑制細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，上調(diào)細(xì)胞的凋亡率。
　　3、GAS5在動(dòng)物模型中亦能抑制SiHa細(xì)胞的增殖能力。
　　第二部分GAS5對(duì)宮頸癌Si

10、Ha及SiHa/cDDP細(xì)胞順鉑耐藥性的影響
　　研究目的:
　　1、構(gòu)建SiHa細(xì)胞的順鉑耐藥細(xì)胞株SiHa/cDDP；
　　2、驗(yàn)證GAS5及miR-21表達(dá)對(duì)SiHa及SiHa/cDDP順鉑耐藥性的影響。
　　研究方法:
　　1、逐步增加宮頸癌SiHa細(xì)胞培養(yǎng)液中順鉑的濃度從而誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞產(chǎn)生耐藥
　　性，建立SiHa細(xì)胞耐順鉑細(xì)胞系。順鉑起始濃度為0.1μg/mL，逐漸遞增，待細(xì)胞能在此濃

11、度穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，再進(jìn)行下一個(gè)較高濃度的誘導(dǎo)。歷時(shí)8個(gè)月構(gòu)建SiHa順鉑耐藥細(xì)胞SiHa/cDDP。
　　2、GAS5慢病毒載體感染SiHa及SiHa/cDDP細(xì)胞，構(gòu)建GAS5穩(wěn)定表達(dá)的SiHa及SiHa/cDDP細(xì)胞。設(shè)計(jì)GAS5-siRNA、miR-21mimic及miR-21inhibitor處理SiHa與SiHa/cDDP細(xì)胞。
　　3、改變GAS5與miR-21表達(dá)水平后觀(guān)察SiHa細(xì)胞與SiHa/cDDP細(xì)胞順鉑敏

12、感性的改變。用不同濃度梯度的順鉑（1、2、3、4、5、6、10、15和30μg/mL）進(jìn)行處理兩種細(xì)胞，CCK8檢測(cè)吸光度計(jì)算出細(xì)胞的存活率。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以??±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法和Student’st檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、

13、成功構(gòu)建SiHa/cDDP細(xì)胞（IC50=12.268μg/mL）的耐順鉑能力為SiHa細(xì)胞（IC50=2.14μg/mL）的5.7倍。倒置顯微鏡下可觀(guān)察到SiHa/cDDP形態(tài)教SiHa細(xì)胞發(fā)生變化，變得更加細(xì)長(zhǎng)，個(gè)別甚至呈現(xiàn)狀。
　　2、GAS5慢病毒載體成功感染SiHa/cDDP細(xì)胞后成功上調(diào)GAS5的表達(dá)水平。3、過(guò)表達(dá)GAS5及抑制miR-21表達(dá)后，SiHa細(xì)胞的凋亡率提高；而抑制GAS5及抑制miR-21表達(dá)后，Si

14、Ha細(xì)胞的凋亡率下降了。
　　4、過(guò)表達(dá)GAS5及抑制miR-21表達(dá)后，SiHa/cDDP細(xì)胞的凋亡率上升，而抑制GAS5及過(guò)表達(dá)miR-21后，SiHa/cDDP細(xì)胞的存活率則上升。
　　結(jié)論:
　　1、GAS5及miR-21對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的順鉑耐藥性有調(diào)節(jié)作用，GAS5能增強(qiáng)順鉑對(duì)SiHa細(xì)胞的殺傷作用，而miR-21則能降低順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。
　　2、GAS5及miR-21對(duì)宮頸癌SiHa/cD

15、DP細(xì)胞的順鉑耐藥性同樣有調(diào)節(jié)作用，GAS5能增強(qiáng)順鉑對(duì)SiHa/cDDP細(xì)胞的殺傷作用，而miR-21則能降低順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷作用。
　　第三部分GAS5對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)活性及順鉑敏感性影響的機(jī)制探討
　　研究目的:
　　分子水平上進(jìn)一步論證GAS5通過(guò)靶向基因微小RNAmiR-21而調(diào)控抑癌基因PTEN及PDCD4的表達(dá)發(fā)揮抑制宮頸生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及耐順鉑的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、過(guò)表達(dá)或抑

16、制GAS5后檢測(cè)HeLa、SiHa及CaSki細(xì)胞的miR-21表達(dá)水平，過(guò)表達(dá)或抑制miR-21后檢測(cè)HeLa、SiHa及CaSki細(xì)胞的GAS5表達(dá)水平，觀(guān)察二者在細(xì)胞水平上的相互調(diào)控。
　　2、WesternBlot檢測(cè)GAS5水平的改變對(duì)PTEN及PDCD4蛋白表達(dá)的影響。
　　3、雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)GAS5及miR-21存在直接調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、三種宮頸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)GAS5水平后檢測(cè)m

17、iR-21的表達(dá)結(jié)果提示miR-21下降，而抑制GAS5表達(dá)后miR-21則上調(diào)，同樣改變miR-21表達(dá)水平再檢測(cè)GAS5表達(dá)得到相似結(jié)果，提示二者有相互調(diào)控關(guān)系。
　　2、改變GAS5的表達(dá)檢測(cè)PTEN及PDCD4，發(fā)現(xiàn)二者有正相關(guān)，說(shuō)明GAS5能夠調(diào)節(jié)PTEN及PDCD4，且呈正向調(diào)節(jié)。
　　3、雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果提示GAS5與miR-21存在結(jié)合位點(diǎn)，二者能直接調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1、GAS5與m

18、iR-21直接相互調(diào)控。
　　2、GAS5能通過(guò)miR-21調(diào)控PTEN及PDCD4發(fā)揮抑癌基因作用。
　　全文結(jié)論
　　1、GAS5異常低表達(dá)與宮頸癌，表達(dá)程度與臨床分期呈負(fù)相關(guān)；GAS5的過(guò)表達(dá)可以顯著抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa及CaSki的增殖、遷移及侵襲能力，增加宮頸癌細(xì)胞的凋亡率；而miR-21異常高表達(dá)于宮頸癌，表達(dá)程度與臨床分期呈正相關(guān)；miR-21能與GAS5直接結(jié)合相互調(diào)控，且GAS5或許能夠通