左旋肉堿對NIH3T3成纖維細胞成骨分化的影響.pdf

1、異位鈣化又稱異位骨化，是指鈣/磷復合物沉積于非鈣化的組織，繼而發(fā)生新骨形成的病理性現(xiàn)象。彈性纖維假黃瘤（pseudoxanthoma elasticum，PXE）是一種多系統(tǒng)的異位鈣化紊亂性疾病，其典型的特征為鈣磷復合物沉積于不同的組織內(nèi)。PXE由ABCC6基因突變引起，該基因編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白ABCC6，該蛋白控制著通過細胞膜的轉(zhuǎn)運。ABCC6基因剔除小鼠是 PXE的小鼠模型，涵蓋了 PXE所有的癥狀。盡管調(diào)節(jié)異位鈣化的分子機制尚不

2、清楚，但是許多證據(jù)都支持這種觀點：異位鈣化是一個細胞調(diào)節(jié)的過程。成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)b）是參與異位骨化的的細胞，存在于全身結(jié)締組織中。研究證實，在適當?shù)拇碳l件下，成纖維細胞可以轉(zhuǎn)化為成骨細胞，最終形成礦化結(jié)節(jié)。
　　左旋肉堿（L-Carnitine，LC）是轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸進入線粒體內(nèi)進行β-氧化的重要的輔助因子。研究表明，LC可以影響成骨細胞的活性。我們對于LC對成骨分化和礦化影響的認識始于實驗室前期的研究，實驗

3、室前期通過代謝組學的方法對ABCC6基因剔除小鼠進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中LC的濃度下降，小鼠出現(xiàn)了全身廣泛的鈣化。因此，我們推測，LC是一種潛在的鈣化或礦化抑制因子。此外，通過動物和人類的研究發(fā)現(xiàn)，補充 LC可以增加血漿中胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors，IGF-1）的濃度，IGF-1可以促進骨基質(zhì)的合成和礦化。IGF-1在激活 IGF-1／PI3K／Akt信號通路中發(fā)揮重要的作用，IGF

4、-1／PI3K／Akt通路的激活可以有效的促進成骨細胞分化和鈣化。
　　目的：本研究旨在探究LC對NIH3T3成纖維細胞的增殖、成骨分化以及礦化的影響，并對其可能的信號通路作進一步的探索，為異位骨化的進一步研究和治療提供一種新的思路。
　　方法：（1）本研究擬采用小鼠胚胎成纖維細胞 NIH3T3細胞建立一個異位礦化的細胞模型。NIH3T3細胞在單磷誘導液（含有2mM Na3PO4的生長培養(yǎng)液）中培養(yǎng)12天，然后采用茜素紅染色

5、和鈣離子檢測的方法對礦化結(jié)果進行檢測。（2）為了檢測LC對單磷誘導的NIH3T3細胞增殖以及成骨分化的影響，NIH3T3細胞在含有10μM和100μM LC的單磷誘導液中培養(yǎng)。擬采用MTT的方法來檢測LC對NIH3T3成纖維細胞增殖的影響。（3）對成骨分化的影響，擬采用熒光定量 PCR的方法檢測成骨標志性基因（Runx2，ALP和 OCN）的表達。對于成骨活性的檢測，擬采用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒來檢測ALP的活性，Western B

6、lot的方法來檢測Runx2蛋白的表達。此外，擬采用茜素紅染色法來觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，采用鈣離子試劑盒檢測鈣離子濃度的方法來檢測基質(zhì)礦化的情況。（4）對IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響，擬采用熒光定量PCR的方法檢測IGF-1基因的表達，western blot的方法檢測IGF-1/PI3K/Akt信號通路中p-Akt蛋白的表達。
　　結(jié)果：（1）茜素紅染色結(jié)果顯示，經(jīng)2mM Na3PO4誘導的NIH3T3細胞（單磷誘導

7、組）產(chǎn)生了礦化結(jié)節(jié)，而正常對照組卻沒有出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色定量以及鈣離子檢測結(jié)果顯示單磷誘導組的鈣離子含量顯著高于正常對照組。（2）MTT檢測結(jié)果顯示10μM LC輕微促進了單磷誘導的NIH3T3細胞的增殖，而100μM LC則輕微抑制了細胞的增殖。（3）熒光定量PCR的結(jié)果表明，與對照組相比，成骨標志性基因Runx2，ALP和OCN，在10μM LC的干預下均出現(xiàn)了輕微的上調(diào)，而100μM LC組則出現(xiàn)了下調(diào)。成骨活性的檢測結(jié)果也

8、表明ALP活性和Runx2蛋白的表達在10μM LC的干預下出現(xiàn)了提高，而100μM LC組則出現(xiàn)了下降。此外，茜素紅染色和鈣離子沉積的結(jié)果也表明10μM LC輕微促進了礦化，而100μM LC抑制了礦化。（4） IGF-1/PI3K/Akt信號通路的檢測結(jié)果表明，與對照組相比，10μM LC輕微促進了IGF-1基因的表達，而p-Akt蛋白的表達卻沒有明顯的變化，但是100μM LC組不但下調(diào)了IGF-1基因的表達，而且p-Akt蛋白的

9、表達也出現(xiàn)了明顯的下降。
　　結(jié)論：Na3PO4促進了NIH3T3成纖維細胞的成骨分化和礦化，我們成功構(gòu)建了異位礦化的細胞模型。研究表明低濃度的LC可以輕微促進NIH3T3成纖維細胞的增殖、成骨分化和礦化，而高濃度的LC對NIH3T3成纖維細胞的增殖、成骨分化和礦化有輕微的抑制。高濃度LC對成骨分化和礦化的抑制與實驗室前期對ABCC6基因剔除小鼠的代謝組學分析結(jié)果相吻合，表明LC是一種潛在的鈣化或礦化抑制因子。此外，高濃度的 LC