shRNA-Smad3對瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響.pdf

1、第一部分：目的：構建抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFB）Smad3基因表達的shRNA真核表達載體，并轉染至原代培養(yǎng)的瘢痕成纖維細胞中，獲得最佳轉染條件。 方法：用前期試驗篩選出的一對最有效siRNA序列重組構建Smad3 shRNA表達質粒。通過脂質體介導的方法，按不同比例，時間及濃度，通過熒光顯微鏡判斷最佳轉染條件。采用組織塊貼壁法進行原代瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng)。 結果：經測序、凝膠電泳分析，成功構建shRNA-Smad

2、3載體，shRNA-Smad3與脂質體比例為1：1.8，在無血清條件下，轉染時間72h后轉染效率最高。原代瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng)成功。 結論：脂質體與DNA質粒適當?shù)谋壤龡l件下加入，在轉染較短的時間內，脂質體法轉染原代培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細胞可使目的基因獲得較高的轉染率，且細胞死亡最少。脂質體是研究原代培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細胞生物學行為較為理想的轉染方法。組織塊法可以得到瘢痕疙瘩成纖維細胞。 第二部分： 目的

3、：研究shRNA-Smad3對KFB轉染到KFB后Smad3、Smad7及COLIA2表達的影響。 方法：通過脂質體介導的方法，將shRNA-Smad3轉染到瘢痕成纖維細胞，用免疫組化，RT-PCR及Western blotting的方法檢測Smad3、Smad7不同時間點（0～9d）表達的變化。 結果：①RT-PCR和Western blotting的結果證實Smad3 shRNA載體構建成功。②轉染Smad3 shR