沙眼衣原體Ahpc基因克隆表達及過氧化物酶活性分析.pdf

1、目的：研究沙眼衣原體（Ct）感染是否引起巨噬細胞氧化損傷，分析 Ct0866（烷基氫過氧化物還原酶，Ahpc）基因在感染過程中的表達及其在Ct抗氧化脅迫中起作用，為了解Ct的抗氧化機制提供實驗基礎。
　　方法：將Ct感染巨噬細胞，并在0h、3h、6h、9h和12h收集細胞，熒光法檢測細胞內 ROS的水平， Realtime-PCR檢測Ahpc基因在感染不同時間的變化情況。以Ct DNA為模板，PCR法擴增Ahpc基因，將其克隆到p

2、ET28a載體。經鑒定后將其轉化至表達菌E.coli BL21，利用IPTG誘導目的蛋白的表達。采用SDS-PAGE對表達產物進行分析并純化重組Ahpc蛋白；采用氧化鐵二甲酚橙法檢測Ahpc蛋白的氫過氧化物酶活性。測定Ahpc蛋白表達的轉基因菌和對照菌在百草枯脅迫下的生長曲線。
　　結果：
　?。?）熒光結果顯示Ct感染能夠誘導巨噬細胞產生ROS，發(fā)現(xiàn)在3h時候其熒光值為1980±310，6h的熒光值為4260±350并且達

3、到高峰，在9h時為2900±245，12h時為2100±250。
　?。?）Ct感染過程中，Ahpc基因的表達上調，在3h時為初始的7.3倍，6h為初始的8.2倍，達到了高峰，然后開始下降，9h時為初始的5.2倍，12h為4.5倍。
　　（3）成功擴增獲得大小為588 bp的Ahpc基因，所構建的原核重組質粒pET28a-Ahpc經PCR和測序鑒定與預期目的基因相符。
　　（4）利用IPTG成功誘導Ahpc蛋白的表達，

4、SDS結果發(fā)現(xiàn)重組菌能夠表達分子約為26kDa的蛋白質，并通過 Ni2+親和層析法純化獲得純度較高的重組Ahpc蛋白。
　?。?） Ahpc蛋白能夠降解叔丁基過氧化氫（t-BHP）和 H2O2。（6）在百草枯引起的氧化應激條件下，轉化pET28a-Ahpc表達載體的大腸桿菌生長要強于對照菌（轉化了空載體pET28a）。
　　結論： Ct感染會導致巨噬細胞產生氧化應激；Ahpc在 Ct感染過程中表達上調；Ahpc蛋白具有氫過氧