經典Wnt信號對結腸癌細胞上皮-間質轉化的影響.pdf

1、背景介紹：
　　Wnt基因廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物，并且在不同物種具有高度的保守性。經典 Wnt信號通路參與多種生理和病理機制，調控細胞增殖、分化、細胞極性、遷移、凋亡等一系列重要過程，尤其在各種干細胞、腫瘤細胞等生命活動活躍的細胞中發(fā)揮關鍵作用。迄今研究表明，經典 Wnt信號功能失調與多種癌癥的發(fā)病機制密切相關，不僅參與惡性腫瘤的發(fā)生，而且促進其發(fā)展和轉移，包括乳腺癌、胃癌、食管癌、結腸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等。

2、　　上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)指上皮樣細胞在特定的生理或病理環(huán)境中向間質樣細胞轉變分化的現象，其逆向過程稱為間質-上皮轉化（mesenchymal epithelial transition, MET）。生理性EMT/MET多見于胚胎發(fā)育和組織愈合修復，而病理性EMT主要參與某些組織的纖維化及惡性腫瘤細胞的轉移，是腫瘤細胞局部浸潤和轉移的關鍵步驟。在EMT過程中，上皮起

3、源的細胞失去其上皮樣表型并逐漸獲得間質樣細胞表型，即細胞極性消失，細胞間的緊密連接減少，黏附能力降低，單層細胞結構不能維持，細胞的遷移、游走能力增加，從而表現出侵襲轉移能力的增強。EMT細胞的典型分子表型變化主要是上皮細胞標志物E型鈣黏蛋白( epithelium-cadherin, E-cad)等表達降低，而N型鈣黏蛋白( N-cadherin, N-cad)、波形蛋白(Vimentin, Vim)等間質細胞標志物表達升高；且多種轉錄

4、因子也相應呈現一系列變化。
　　EMT受多種分子信號通路調控，目前研究表明，經典Wnt信號通路（又稱Wnt/β-catenin通路）參與某些生理和病理的EMT/MET的調節(jié)。如在小鼠腎小管發(fā)育中，敲除 Wnt基因可有效阻斷間質樣細胞遷移和組織局部腎小管上皮細胞的形成，采用基因敲除的方法干擾Wnt/β-catenin信號通路，顯著影響EMT介導的腫瘤轉移病灶的發(fā)生，顯示了該通路在腫瘤轉移中的重要意義，提示針對Wnt/β-cateni

5、n信號通路的靶向性治療具有阻斷腫瘤轉移的潛在意義。目前已證實Wnt/β-catenin信號通路失調是結腸癌發(fā)病的重要誘因，該通路是否促進結腸癌的浸潤與轉移尚需進一步研究。
　　目的：
　　本實驗選用體外培養(yǎng)的結腸癌細胞系HCT116細胞作為實驗對象，利用基因重組蛋白Dkk1和Wnt3a分別抑制和激活Wnt/β-catenin信號通路，采用細胞劃痕實驗和實時熒光定量聚合酶鏈反應（polimerase chain reactio

6、n, PCR），觀察Wnt/β-catenin信號通路活性改變對細胞遷移的影響以及對EMT特征性分子和相關轉錄調控因子基因表達的影響，從而確定 Wnt/β-catenin信號通路對結腸癌細胞EMT的調控作用。
　　方法：
　　1．HCT116細胞的體外培養(yǎng)。結腸癌細胞系 HCT116購自中國科學院上海生命科學學院細胞庫，用含10％胎牛血清（Fetal bovine Serum, FBS）的MyCoy’s5a培養(yǎng)基制備單細胞懸

7、液，以1×105/ml密度接種（5ml/瓶），置于37?C，5%CO2和飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察。當細胞生長至大約覆蓋培養(yǎng)瓶底部90%時，按照1：5的比例進行細胞傳代培養(yǎng)。
　　2．實驗分組。HCT116細胞分為三組分別是：（1）對照組：HCT116細胞；（2）抑制劑組：HCT116細胞+Dkk1（100ng/ml）；（3）激動劑組：HCT116細胞+Wnt3a（40ng/ml）。采用常規(guī)培養(yǎng)液制備 HCT116的單細胞

8、懸液，以1×106/孔的密度接種于六孔板，每組設3個平行孔。24h后待細胞貼壁生長時開始上述抑制劑和激動劑的處理。
　　3．細胞劃痕實驗。HCT116細胞培養(yǎng)24h后，細胞貼壁生長，覆蓋大約80%的培養(yǎng)板表面。用無菌槍頭在六孔板每孔中央沿直徑方向畫一條粗細均勻的劃痕，仔細刮去劃痕線右側所有的細胞，保留左側細胞完好。棄去培養(yǎng)基并用PBS沖洗3次除去漂浮的細胞，換成含2%FBS的MyCoy’s5a培養(yǎng)基，并按上述分組所示加入Dkk1（

9、100ng/ml）或Wnt3a（40ng/ml）。此時記為0h，使用倒置顯微鏡在每孔中沿劃痕線從上至下劃分為8個連續(xù)的觀察視野，分別在0h、12h、24h、48h時，觀察各個視野中的細胞遷移情況并采集圖片，將得到的細胞圖像數據用Image Pro Plus6.2進行分析處理，分別計算對照組、抑制劑組和激動劑組越過劃橫線的細胞數。
　　4．細胞周期檢測。HCT116細胞培養(yǎng)24h后，細胞貼壁生長；按照方法2分組處理48h后，收集3組

10、細胞，PBS清洗3次，用冷無水乙醇固定過夜，離心后加入碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）和RNA酶混合的DNA染色溶液（每樣本200μl）重懸混勻，室溫下避光孵育30min后，PBS清洗3次，用流式細胞儀檢測細胞周期。結果采用細胞周期擬和軟件ModFit進行分析。
　　5．實時熒光定量PCR檢測Wnt信號通路相關基因、EMT特征性分子及轉錄調控因子的基因表達變化。采用總RNA提取試劑盒分別提取處理48h后對照組、

11、抑制劑組和激動劑組的總RNA，使用Nanodrop精確測定RNA濃度和純度，各樣本以等量的總RNA反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測各組基因表達變化，包括：Wnt信號通路相關基因β-catenin，Axin2，C-myc，Wntless；EMT特征性分子的基因E-cad，N-cad，Vim；參與EMT的關鍵轉錄調控因子基因Slug，Snail，ZEB1，ZEB2， Twist， MMP2，MMP3。β-actin為內參基因，

12、 ROX為加樣參照熒光。根據-σTT分別計算抑制劑組和激動劑組與對照組基因表達量的相對比值。
　　6．統(tǒng)計學處理。上述實驗均重復3次，使用 SPSS10.1統(tǒng)計軟件，采用 t檢驗法分別將抑制劑組和激動劑組與對照組進行分析比較，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1．HCT116細胞按1:5傳代，呈單層聚集生長，細胞形態(tài)為上皮樣細胞，呈多邊形、卵圓形，細胞增殖能力旺盛，細胞之間連接緊密，胞間沒有空隙,連續(xù)傳代的細胞不

13、出現可識別的形態(tài)及生長特性的改變。
　　2．調節(jié)經典Wnt信號通路的活性，通過細胞劃痕實驗可以看出，對照組至24h時才發(fā)生明顯細胞遷移；激動劑組（Wnt3a-40ng/ml）在12h時就可以觀察到細胞遷移；抑制劑組（Dkk1-100ng/ml）在實驗觀察的48h內始終沒有明顯的細胞遷移現象。
　　3．調節(jié)經典Wnt信號通路的活性，并用流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示，對照組處于 S期的細胞占10.2%±0.45%，抑制劑組處

14、于 S期的細胞占9.4%±0.2%，激動劑組處于 S期的細胞占11.1%±0.3%。統(tǒng)計學分析顯示，抑制劑組和激動劑組分別與對照組的S期細胞相比，差異無顯著性。
　　4．實時熒光定量PCR檢測結果顯示，采用Wnt3a（40ng/ml）處理48h顯著激活Wnt/β-catenin信號通路，表現為經典Wnt信號通路的關鍵基因β-catenin和相關調控基因Wntless的表達顯著上調；同時，上皮細胞標志物E-cad表達下調，而間質細胞

15、標志物N-cad、Vim等表達顯著上調。當采用Dkk1（100ng/ml）抑制 Wnt/β-catenin信號通路的活性時，上述基因表達呈現相反的變化。統(tǒng)計分析顯示，抑制劑組和激動劑組分別與對照組相比，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　5．實時熒光定量PCR檢測結果還顯示，EMT相關的轉錄調節(jié)因子也出現明顯變化。當Wnt3a（40ng/ml）激活Wnt/β-catenin信號通路時，轉錄調節(jié)因子Snail、Slug、ZEB1、

16、Twist、MMP3表達均上調。相反，當采用 Dkk1抑制Wnt/β-catenin信號通路時，上述基因表達下調。統(tǒng)計分析顯示，抑制劑組和激動劑組分別與對照組相比，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　結論：
　　1．體外培養(yǎng)條件下，經典 Wnt信號通路調節(jié)結腸癌細胞上皮-間質轉化，激活該信號通絡可促進細胞遷移和間質樣細胞表型，抑制該信號通路結果相反。
　　2．經典 Wnt信號通路對上皮-間質轉化的調控作用可能與轉錄調