SphK1信號(hào)通路和FAK對(duì)HCT-116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的：研究鞘磷酸激酶1（SphK1）信號(hào)通路和粘著斑激酶（FAK）對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，初步探討SphK1和FAK在結(jié)腸癌發(fā)展進(jìn)程中的臨床意義及機(jī)制研究。
　　方法：將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116分成3組： FAK抑制劑組、SphK1抑制劑組和空白對(duì)照組；根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別采用5μmol/L的SphK1抑制劑N，N-二甲基鞘胺醇（DMS）、10μmol/L FAK抑制劑PF573228和

2、相同體積的培養(yǎng)基處理人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞48 h。采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，采用免疫印跡方法（Western blotting）檢測(cè)SphK1、FAK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP2蛋白的表達(dá),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)SphK1、S1P、FAK、E-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力。
　　結(jié)果：

3、PF573228和DMS均呈時(shí)間劑量依賴性的抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的增殖。Western blotting結(jié)果表明DMS抑制SphK1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)FAK、N-cadherin、Vimentin和MMP2蛋白的表達(dá)，而E-cadherin蛋白表達(dá)增加；PF573228明顯抑制FAK的表達(dá)，同時(shí)抑制SphK1、N-cadherin、Vimentin和MMP2的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白。SphK1的蛋白表達(dá)結(jié)果為，PF5

4、73228組（0.78±0.03)，DMS組(0.83±0.05)均低于對(duì)照組(1.34±0.06)(P<0.01)；FAK的蛋白表達(dá)結(jié)果為，PF573228組(0.87±0.04)，DMS組(0.84±0.07)均低于對(duì)照組(1.35±0.03)(P<0.01)；E-cadherin的蛋白表達(dá)結(jié)果為，PF773228組(1.28±0.06)，DMS組(1.10±0.03)均高于對(duì)照組(0.67±0.06)(P<0.01)； N-cad

5、herin的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，PF573228組(0.84±0.02)，DMS組(0.73±0.02)均低于對(duì)照組(1.41±0.05)(P<0.01)；Vimentin的蛋白表達(dá)結(jié)果為，PF573228組(0.52±0.01)，DMS組(1.04±0.02)均低于對(duì)照組(1.36±0.01)(P<0.05)；MMP2的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，PF573228組(0.98±0.02)，DMS組(0.86±0.06)均低于對(duì)照組(1.14±0.

6、04)(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的mRNA結(jié)果顯示，SphK1、FAK、S1P和Vimentin基因表達(dá)降低，而E-cadherin基因表達(dá)增加。具體結(jié)果為：與對(duì)照組比較，PF573228組和DMS組FAK的mRNA表達(dá)（1.00±0.00 vs0.16±0.01，0.38±0.03）、SphK1的mRNA表達(dá)（1.00±0.00 vs0.21±0.08，0.55±0.1)、S1P的mRNA表達(dá)（1.00±0.00

7、 vs0.08±0.01，0.30±0.06）以及Vimentin的mRNA表達(dá)（1.00±0.00 vs0.24±0.08，0.30±0.06）均明顯下調(diào)，而E-cadherin的mRNA的表達(dá)（1.00±0.00 vs1.56±0.21,2.39±0.30）則明顯上調(diào)（P<0.05或0.01）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組及藥物干預(yù)組24h細(xì)胞遷移距離分別為：對(duì)照組(93.87±6.06)μm、PF573228(22.97±9.54)μ