利用紅色熒光蛋白構建直觀判斷重組子的大腸桿菌表達載體.pdf

1、應用大腸桿菌表達重組蛋白時，為了能夠方便、直觀、快速高效地選擇出含有目的基因的重組克隆，選擇紅色熒光蛋白作為報告基因，目標構建出在轉化次日就能通過菌體顏色的明顯變化，判斷出重組克隆的新型載體:即未插入外源基因的菌落顯示紅色，插入外源基因的菌落不顯示紅色。本文通過研究不同類型的啟動子、紅色熒光蛋白DNA序列、誘導劑影響以及紅色熒光蛋白氨基酸序列幾個方面，優(yōu)化得到最佳的表達載體。
　　 首先采用T7、lac和tac啟動子表達系統(tǒng)，把

2、紅色熒光蛋白(DsRed2)基因插入到各種載體質粒中，轉化BL21(DE3)宿主菌。結果表明，重組菌落可以顯示紅色，但需要數(shù)天時間，三種啟動子無明顯差別。
　　 通過對DsRed2基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)該基因存在兩個在大腸桿菌中表達的不利因素:(1)GC含量高且分布不均勻，易于形成二級結構，不利于DNA-RNA-蛋白質的遺傳信息的有效流動;(2)RFP中有12個脯氨酸，其密碼子全部為CCC，這是大腸桿菌使用頻率最低的密碼子。由于這

3、兩個缺點都不利于RFP基因在大腸桿菌中的高水平表達，通過全基因合成方法，實現(xiàn)了將(DsRed2)基因序列進行優(yōu)化，通過提高RFP的表達水平來加快含有RFP基因的重組菌落顯示紅色的速度。結果表明含有全基因合成RFP的重組菌落顯色速度有所提高。
　　 接著研究了利用誘導劑加速菌落顏色變化的實驗，通過添加不同類型和濃度的誘導劑，發(fā)現(xiàn)半乳糖可以加快RFP菌落變色速度，縮短變色時間。
　　 最后通過對RFP基因中氨基酸序列的分析，

4、發(fā)現(xiàn)某些位點的氨基酸突變，有利于加快紅色熒光蛋白結構的成熟速度。所以對DsRed2基因進行了7個氨基酸的定點突變:S4T、N6D、V7D、H41T、N42Q、V44A、A145P。實驗結果表明，帶有7點突變RFP基因的重組菌落仍然不能在預期的轉化次日顯示紅色。當進一步分析后發(fā)現(xiàn)A145P這一位點的突變，導致RFP蛋白結構發(fā)生重要改變，不利于紅色熒光蛋白正確結構的呈現(xiàn)。最后僅對有利于RFP快速成熟的H41T、N42Q、V44A三個位點突變