人表皮和毛囊的細(xì)胞培養(yǎng)及黑素細(xì)胞重編程的研究.pdf

1、目的：
　　(1)觀察表皮細(xì)胞在三種培養(yǎng)基中的生長狀況，檢測不同時間點培養(yǎng)上清中內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）和干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF）的水平；
　　(2)連續(xù)觀察成人頭皮毛囊外根鞘（Outer root sheath, ORS）和毛乳頭(Dermal papilla,DP)細(xì)胞的生長及形態(tài)學(xué)變化；
　　(3)采用3個因子轉(zhuǎn)染人表皮黑素細(xì)胞（melanocytes, MC

2、s）成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。
　　方法：
　　(1)采用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮細(xì)胞，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時收集培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測ET-1和SCF水平，同時比較不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長狀態(tài)；
　　(2)利用兩步酶消化獲得正常人頭皮毛

3、囊的ORS和DP，采用添加人角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加物（human keratinocyte growth supplement，HKGS）和人黑素細(xì)胞生長添加物（human melanocyte growth supplement，HMGS）的K-SFM進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察毛囊ORS和DP的遷移和生長；
　　(3)用分別攜帶Oct4、Klf-4和c-Myc因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人表皮MCs，對生成的克隆進(jìn)行堿性磷酸酶染色

4、（AP）、甲基化水平檢測、干細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)抗體的免疫熒光染色、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)、體外誘導(dǎo)三胚層分化。
　　結(jié)果：
　　(1)三組培養(yǎng)上清中，培養(yǎng)基2（M2）中上清ET-1的含量最高；隨著時間延長ET-1含量均增加，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；三組培養(yǎng)上清中SCF含量在第24～48小時含量顯著下降，三者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。換液后ET-1和SCF變化趨勢基本同換液前（P＜0.01）。M2中細(xì)

5、胞增殖最快，角質(zhì)形成細(xì)胞（keraticytes, KCs)呈集落樣生長，MC的樹突較多。培養(yǎng)基1(M1)中貼壁細(xì)胞數(shù)目少，死亡細(xì)胞多，細(xì)胞增殖緩慢，KCs散在，MCs多是雙極。培養(yǎng)基3（M3）細(xì)胞生長情況介于M1和M2兩組之間；
　　(2)將單個毛囊置于預(yù)先涂布血清的培養(yǎng)板2小時，然后添加少量培養(yǎng)基，毛囊粘附于培養(yǎng)板的幾率增加，數(shù)小時后，即可見細(xì)胞從ORS及DP處遷移生長，以KCs、成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs)

6、為主，MCs較少。并且，ORS和DP的遷出和生長有明顯不同。如果培養(yǎng)基過多，則多數(shù)毛囊懸浮，無細(xì)胞遷出，最終死亡。
　　(3)采用攜帶Oct4、Klf-4和c-Myc因子的3個慢病毒載體轉(zhuǎn)染人表皮MCs，轉(zhuǎn)染后第6天，開始形成克隆。第1代和第3代iPSCs的AP染色為陽性；與母本相比，Oct4和Nanog基因位點部分去甲基化，透射電鏡觀察可見細(xì)胞增生活躍，部分細(xì)胞中有3個核仁，極少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞漿中可見散在I和II期黑素體。將第5代

7、iPSCs懸浮培養(yǎng)獲得擬胚體，后者貼壁培養(yǎng)后，干細(xì)胞相關(guān)抗體染色顯示Sox2陽性、Cdy1強陽性。用第5代克隆進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在分化后2周，顯示代表脂肪細(xì)胞的油紅染色陽性，代表肝細(xì)胞的白蛋白染色陽性，但代表神經(jīng)元標(biāo)記的相關(guān)染色陰性。
　　結(jié)論：
　　(1)培養(yǎng)基中高水平ET-1有利于表皮細(xì)胞的貼壁、增殖和分化。在培養(yǎng)過程中表皮細(xì)胞能夠分泌ET-1，并釋放入培養(yǎng)上清。表皮細(xì)胞培養(yǎng)消耗SCF，但無明顯表皮分泌作用。
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