人骨髓間充質干細胞分化為軟骨細胞的實驗研究.pdf

1、目的 本實驗旨在探討人骨髓MSCs(hMSCs)的分離、純化、體外擴增以及向軟骨細胞分化的條件。使用特定的誘導培養(yǎng)基對骨髓間充質干細胞進行誘導培養(yǎng)，用半定量RT-PCR的方法檢測其是否表達Ⅱ型膠原，探討骨髓間充質干細胞在體外向軟骨細胞分化的可能性，為MSCs應用于軟骨組織工程，修復損傷的軟骨組織提供理論依據(jù)和技術支持。 方法 無菌條件下臨床采集無血液系統(tǒng)疾病和家族遺傳史的28-65歲成人骨髓8例，用含1O％

2、FBS的DMEM培養(yǎng)液5倍稀釋，2000rpm離心5min，棄上清及脂肪層，加入5ml含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，制成細胞懸液。將其接種于間充質干細胞培養(yǎng)液(低糖DMEM，含10％FBS，100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)中，置于37℃、5％C0<,2>飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。3天后更換培養(yǎng)液，小心棄去未貼壁細胞。以后每3天換液一次。待細胞長至鋪滿瓶底80％時，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代，再以(6-8)×10<'3>/

3、cm<'2>的密度接種傳代培養(yǎng)：去除培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，用0.25％的胰蛋白酶置37℃、5％C0<,2>飽和濕度的孵箱內(nèi)消化3-5分鐘，見細胞松動浮起時，F(xiàn)BS終止消化，1500rpm離心5分鐘，棄上清，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，調整細胞濃度，接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，3ml/瓶，置于37℃、5％C0<,2>和飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次。取第取擴增至第3代的hMSCs以5×10<'4>/ml的密度接種于預先

4、放置有消毒處理好的蓋玻片的6孔板內(nèi)。細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。實驗分2組。實驗組每孔加入2ml無血清低糖DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含2mg/L胰島素、3mg/L轉鐵蛋白、1mmo1/L丙酮酸、100nmo1/L地塞米松和10μg/LTGF-β<,1>。對照組每孔加入2ml低糖DMEM基礎培養(yǎng)液。每組加3孔。細胞在37℃、5％C0<,2>和飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3-4天換液1次。分別在誘導后的7天、14天取出玻片，進行細胞形態(tài)學、組織化學分析，與及

5、MSCs誘導分化的軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達的檢測。 結果 原代培養(yǎng)時細胞接種24小時后即有少量圓形細胞貼壁，48小時后貼壁細胞增多。72小時后已出現(xiàn)數(shù)個細胞集落，每個集落約由幾個到幾十個細胞組成，此時培養(yǎng)液中仍有許多懸浮細胞。經(jīng)過2-3次換液后，懸浮細胞多已被去除，貼壁變形的細胞增多，有的細胞已伸長形成長梭形或多角形，呈成纖維樣細胞形態(tài)，胞漿內(nèi)有細胞小顆粒，核大、圓形或橢圓形。培養(yǎng)瓶中的細胞集落逐漸增多，增大，1

6、2-14天時集落逐漸相互融合。傳代培養(yǎng)后細胞的生長速度明顯加快，經(jīng)歷24-48小時后的緩滯期后迅速進入對數(shù)生長期，10-15天鋪滿瓶底。誘導7天及14天后骨髓MSCs蕃紅花-O染色陽性，而對照組細胞染色陰性。表明經(jīng)誘導后的骨髓MSCs有粘多糖的分泌。經(jīng)半定量RT-PCR檢測，誘導7天和14天的骨髓MSCs表達COL2A1 mRNA，對照組未見表達。表明經(jīng)誘導后的骨髓MSCs有軟骨細胞特異性Ⅱ型膠原mRNA表達。 結論