淫羊藿苷誘導人臍帶間充質干細胞分化為成骨細胞的實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　 人臍帶間充質干細胞的體外分離及定向培養(yǎng)是目前組織工程學的熱點。研究淫羊藿苷對人臍帶間充質干細胞的生物學作用，以及誘導其向成骨細胞分化的可能。嘗試為骨組織工程找到一個新的體外誘導成骨細胞的方案。
　　 方法：
　　 無菌條件下取39～40周健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后1h的臍帶（均征得產(chǎn)婦及其家屬同意），去除外膜及血管后，將臍帶組織剪碎，接種于培養(yǎng)瓶中。采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)并傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長

2、情況，免疫細胞化學染色法鑒定細胞表面抗原標志物(CD34，CD44，CD105，CD45)。取生長狀態(tài)良好的第3代細胞進行細胞爬片，待細胞生長至80％-90％融合時分為2組進行誘導分化，空白對照組加入基礎培養(yǎng)基，實驗組加入淫羊藿苷和基礎培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)并檢測成骨細胞標志物ALP、堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性測定、鈣化結節(jié)的檢測。將結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 臍帶間充質干細胞原代細胞培

3、養(yǎng)4天后，可見組織塊周圍細胞成放射狀生長，類似成纖維細胞，形態(tài)均一，貼壁狀態(tài)。培養(yǎng)15天后，培養(yǎng)瓶有80％-95％融合，按照1:2或者1:3的比率傳代，傳代后4h細胞貼壁，1-6代細胞12h貼壁率＞85％，24h貼壁率可達90％。6～8d細胞長滿瓶底，細胞融合率可達100％。傳代細胞在生長的過程中呈現(xiàn)間充質干細胞的形態(tài)特點。第3代臍帶間充質干細胞免疫組化染色，顯示表面標CD44、CD105強陽性，CD34、CD45陰性，檢測結果符合人U

4、CMSCs的特征。誘導培養(yǎng)后形態(tài)學檢測：實驗組可見大量臍帶間充質干細胞由漩渦狀排列向多角形，立方形細胞發(fā)展?？瞻讓φ战M干細胞無明顯變化。成骨性檢測：隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，實驗組誘導后細胞液中成骨細胞特征性堿性磷酸酶強陽性表達并且有鈣沉積。實驗組細胞內(nèi)ALP含量與對照組比較有顯著性差異(P＜0.001)，實驗組鈣化結節(jié)染色強陽性。
　　 結論：
　　 本實驗證明了人臍帶中可以提取干細胞并在體外采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)，傳代，