造血細胞分化相關基因的鑒別以及ASB-8和mir-223的功能研究.pdf

1、人類造血涉及多能干細胞的自我更新、向多個造血細胞鏈系的分化決定及進一步分化發(fā)育成熟。這個過程涉及關鍵的轉(zhuǎn)錄因子和造血生長因子的協(xié)同調(diào)控。為了研究造血干細胞鏈系分化的分子機制，我們首先用免疫磁珠(MACS)從正常成人骨髓中分離CD341+細胞，用特異的表面標志進一步分離獲得造血干細胞(HSC；CD34+/CD38-/CD33-)和多能髓系祖細胞(MMP;CD34+/CD38-/CD33+)。同時用特異的細胞因子分別誘導CD34+細胞向紅系

2、、巨核系和粒系分化，收集紅系祖細胞衍生的集落(EC)、巨核系祖細胞衍生的集落(MC)和粒系祖細胞衍生的集落(GC)。從這些細胞制備RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄差異顯示PCR(DDRT-PCR)分析，共獲得差異表達條帶(ESTs)近500條。挑選差異表達顯著的條帶進行PCR再擴增、克隆到T載體、DNA測序并在NCBI進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)這些ESTs所代表的基因為轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導分子、細胞代謝酶類、細胞周期調(diào)控因子、細胞凋亡相關分子、腫瘤相關分

3、子、核糖體蛋白和未知功能的基因。我們發(fā)現(xiàn)特異的基因表達上調(diào)和特異的基因表達下調(diào)都在HSC鏈系特異分化中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為揭示造血細胞分化的分子機制提供了線索。 粒系形成包括HSC向粒系祖細胞的分化決定和進一步分化發(fā)育成具有功能活性的成熟粒細胞。這個過程不僅涉及粒系特異轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，還涉及細胞因子及其受體、其它轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。我們研究了DDRT-PCR分析中一個在GC中特異高表達的基因ASB-8在粒系分化中的作用。用rea

4、l-time PCR分析驗證了ASB-8在GC中高表達，存HSC、MMC、EC和MC中表達很低。在全反式視黃酸(ATRA)誘導NB4和HL-60向粒系分化的過程中，ASB-8 mRNA表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。pEGFP-N1-ASB-8融合蛋白定位于NIH-3T3的細胞質(zhì)，并集中在核周圍。 構(gòu)建了ASB-8的過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-ASB-8和RNAi質(zhì)粒pAVU6+27-ASB-8i，分別轉(zhuǎn)染NB4獲得ASB-8的過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

5、子pcDNA3.1-ASB-8/NB4和RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pAVu6+27-ASB-8i/NB4。與NB4相比，在ATRA誘導之前，在pcDNA3.1-ASB-8/NB4中CD11b mRNA的表達升高，而MPO mRNA的表達無明顯變化。在ATRA誘導向粒系分化中，CD11b mRNA在pcDN-A3.1-ASB-8/NB4的表達均要高出在相應誘導時間的NB4細胞中的表達，而MPO mRNA的表達無明顯差別，但在96h降低為1/3。在

6、ATRA誘導之前，在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11bmRNA和MPO mRNA的表達分別只有NB4中的1/10和1/2。在ATRA誘導向粒系分化過程中，在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11b mRNA一直處于極低的表達水平，而MPO mRNA的表達基本保持不變。在ATRA誘導向粒系分化48h后，NBT還原試驗發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ASB-8/NB4和pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的A<,570>

7、nm/10<'6>(細胞)要比NB4分別增加13％和減少20％；Gimesa染色發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ASB-8/NB4中的細胞核分葉比NB4中更多，而pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的細胞核分葉則更少。這些結(jié)果說明過表達ASB-8促進ATRA誘導的NB4向粒系的分化，而ASB-8的表達阻遏則抑制ATRA誘導NB4向粒系的分化。 近來的研究表明miRNAs可能參與造血細胞分化的調(diào)控。我們課題組先前發(fā)現(xiàn)mir-223在紅系

8、分化中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用，本文進一步研究mir-223調(diào)節(jié)紅系分化的功能和機制。通過分別轉(zhuǎn)染寡核苷酸小RNA223前體(Pre-mir-223)和小RNA223抑制劑(Anti-mir-223)，分別觀察到聯(lián)苯胺染色陽性細胞百分比以及γ-珠蛋白mRNA表達的降低和升高，說明在K562中mir-223的過表達和表達阻遏分別抑制和促進hemin誘導的紅系分化。我們構(gòu)建了mir-223過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-pri-mir-223(小

9、RNA223初級轉(zhuǎn)錄本)和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223，分別轉(zhuǎn)染K562細胞，獲得mir-223過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pcDNA3.1-pri-mir-22/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562。在hemin誘導向紅系分化中，在pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562中的聯(lián)苯

10、胺染色陽性細胞百分比和γ-珠蛋白mRNA表達均要低于K562，進一步說明在K562中過表達mir-223會抑制hemin誘導的紅系分化。為了鑒別mir-223的靶基因，把LMO2和HLF的3’-UTR插入到pRL-TK和pEGFP-C1，構(gòu)建了LMO2和HLF-雙螢光和熒光報告基因質(zhì)粒，與Pre-mir-223共轉(zhuǎn)染K562和NIH-3T-3，發(fā)現(xiàn)LMO2和HLF-報告基因的表達受到抑制，說明LMO2和HLF可能是mir-223的靶基因

11、。把LMO2-報告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562、pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562和K562中，發(fā)現(xiàn)LMO2-報告基因在過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子中的表達受到抑制。Real-time PCR還發(fā)現(xiàn)LMO2 mRNA在mir-223過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子中的表達要低于K562，這些說明LMO2很可能就是mir-223的靶基因。 這些結(jié)果提示在hemin誘