小鼠GV期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能評(píng)價(jià)和GDNF對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟、受精和胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、第一部分實(shí)驗(yàn)研究
　　第一章小鼠GV期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能評(píng)價(jià)
　　卵母細(xì)胞作為雌性生殖細(xì)胞，為哺乳動(dòng)物繁殖提供遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，并支持著床前胚胎的發(fā)育。卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量直接決定了早期胚胎能否正常發(fā)育。卵母細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立對(duì)體外胚胎發(fā)育的預(yù)測(cè)具有重要作用。在臨床上，對(duì)于有排卵障礙的病例而言，生發(fā)泡(Germinal Vesicle，GV)期卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精或單精注射是人類輔助生殖技術(shù)的重要組成部分，因此，篩選優(yōu)良發(fā)

2、育潛能的GV期卵母細(xì)胞是人類輔助生殖技術(shù)成功的前提。
　　卵丘細(xì)胞層厚度(thickness of cumulus layers，C)、透明帶厚度(thickness ofzona pellucida，Z)和帶下間隙寬度(perivitelline space，P)是卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的三個(gè)重要參照物。然而，這三個(gè)形態(tài)學(xué)特征與GV期卵母細(xì)胞質(zhì)量之間的關(guān)系還并未被廣泛研究。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，對(duì)卵丘細(xì)胞層厚度、透明帶厚度和帶下間

3、隙寬度進(jìn)行分級(jí)，研究了這三個(gè)形態(tài)學(xué)特征與GV期卵母細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)系。更進(jìn)一步，通過人為改變卵丘細(xì)胞層厚度、透明帶厚度和帶下間隙寬度，深入研究了這三個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能標(biāo)準(zhǔn)的可靠性。
　　我們的研究結(jié)果表明:(1)帶有三層及以上卵丘（C≥50μm）的卵母細(xì)胞具有較高的成熟率、受精率和胚胎發(fā)育率，人為去除部分卵丘雖不影響卵母細(xì)胞的體外成熟率，但影響了后期的受精率和胚胎發(fā)育率。(2)透明帶厚度在5-8μm之間（5μm≤Z＜

4、8μm）的卵母細(xì)胞具有較高的成熟率，透明帶厚度小于5μm（Z＜5μm）的卵母細(xì)胞不能夠正常成熟和受精。人為將透明帶厚度從大于或等于8μm（Z≥8μm）變薄至5-8μm(5μm≤ Z＜8μm)，雖然可以提高卵母細(xì)胞成熟率，但不能提高受精率和發(fā)育率。(3)較寬的帶下間隙(P≥5μm)有利于卵母細(xì)胞極體的排放，但不利于卵母細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育。帶下間隙小于1μm(P＜1μm)的卵母細(xì)胞不能夠成熟，即使人為擴(kuò)大帶下間隙，也不能夠改善卵母細(xì)胞的發(fā)

5、育潛能。
　　我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了GV期卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層厚度、透明帶厚度和帶下間隙厚度可以作為預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育潛力的指標(biāo)，這些結(jié)果為人類輔助生殖提供參考數(shù)據(jù)，對(duì)提高人類輔助生殖成功率有重要意義。
　　第二章GDNF對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育的影響
　　對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物而言，繁衍后代是生命周期中除個(gè)體生存之外最重要的生命活動(dòng)。后代的繁衍起始于雌性動(dòng)物卵母細(xì)胞生長、成熟、受精和早期胚胎發(fā)育。

6、對(duì)于良種家畜例如牛和羊而言，人們常采用體外受精(In Vitro Fertilization，IVF)和胚胎移植(Embryo transfer,ET)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)繁，并且IVF-ET技術(shù)是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究關(guān)鍵步驟之一。這一技術(shù)是以卵母細(xì)胞的體外成熟開始的，因此，卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的好壞直接影響了后代的產(chǎn)出。
　　卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中除內(nèi)源性的基因表達(dá)與調(diào)控之外，外界信號(hào)分子也是影響其能否正常發(fā)育的重要調(diào)控方式之一。這種

7、調(diào)控最常見也是最直接的方式之一就是通過旁分泌因子來發(fā)揮作用。GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，最早是從大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系上清液中分離出來的。研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)小鼠、豬卵母細(xì)胞成熟、受精和早期階段胚胎的發(fā)育起重要作用。因此，我們利用牛卵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，研究了GDNF對(duì)成熟、受精和胚胎發(fā)育的作用。
　　我們采用了免疫組化和免疫熒光方法，研究了GDNF在成熟卵泡、GV期卵母細(xì)胞、MⅡ期卵母細(xì)胞和早期胚胎中的定位。卵母細(xì)胞成熟液和早期胚胎發(fā)育液中添

8、加適量的GDNF因子對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響。用特異性的siRNA干擾受體GFRA1的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)牛卵母細(xì)胞成熟率。
　　我們的結(jié)果表明，(1)牛GV期卵母細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)GDNF因子，只檢測(cè)到它的受體;而卵母細(xì)胞成熟的其他時(shí)期和胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中均檢測(cè)到GDNF及它的受體信號(hào)。(2)添加適量的GDNF對(duì)卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用。(3)干擾GFRA1的表達(dá)，導(dǎo)致牛卵母細(xì)胞成熟率顯著低于對(duì)照組。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果