HEK293 6E細胞瞬時基因表達平臺的建立及應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、重組蛋白藥物在市場中需求量越來越大。哺乳動物細胞能夠進行復雜的翻譯后加工修飾使蛋白產物更接近天然構象，從而在各種重組蛋白表達系統(tǒng)中占據(jù)優(yōu)勢地位。近來，瞬時基因表達系統(tǒng)發(fā)展迅速，通過瞬時表達可以快速的獲取大量的高活性重組蛋白。本研究的策略是通過摸索HEK2936E懸浮細胞的無血清瞬時轉染條件和轉染方法，并通過Fed-Batch方式補料維持細胞良好狀態(tài)來達到提高瞬轉產量。
　　 本研究以綠色熒光蛋白GFP、嵌合抗體10F7 cAb為

2、報告基因來評價轉染和補料等條件對瞬時表達產量的影響;以人源化抗體E6F6 hAb、嵌合抗體129G1cAb、嵌合抗體5F9 cAb為報告基因來評價信號肽改造、密碼子優(yōu)化對瞬時表達產量的影響。HEK2936E細胞無血清轉染優(yōu)化條件包括培養(yǎng)基、真核載體、DNA/PEI比例、細胞密度、轉染方法等等。經過優(yōu)化后在4×106 cells/ml細胞密度下以PEI為轉染試劑，pTT5為表達載體，DNA/PEI為1/8條件下轉染，轉染效率可以達到60％

3、以上，10F7cAb產量可由初始40mg/L提高至313mg/L。而采用DOP轉染方法的轉染效率可到70％以上，10F7cAb產量可達400mg/L。
　　 為改善細胞轉染后的表達條件及提高表達水平，本研究采用Fed-Batch的方式添加營養(yǎng)物質，營養(yǎng)物質包括動物蛋白水解物，丁酸鈉，維生素B12，檸檬酸鐵，F(xiàn)M補料培養(yǎng)基等。這些營養(yǎng)物質對目的蛋白的產量提高效果不盡相同，提高范圍從15％至35％，最高表達產量可達553mg/L。本

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