大米蛋白抗氧化肽的制備、分離純化和結構鑒定.pdf

1、大米蛋白質(zhì)具有高生物效價、低過敏性等重要特點，受到了全世界研究者的關注。我國目前還存在著大量不適于直接食用的早稻、碎米、庫存陳化米，以及工業(yè)消費生成的米渣、米糟，可以提供豐富的大米蛋白資源?？寡趸?，作為一種天然抗氧化劑，具有強的抗氧化活性和高的安全性，引起了研究者的廣泛興趣。因此，充分開發(fā)利用大米蛋白制備抗氧化肽是重要的研究課題，具有一定的社會和經(jīng)濟效益。
　　 本論文以秈米為原料，采用堿溶酸沉法提取得到大米蛋白濃縮物；采用不

2、同的蛋白酶酶解，篩選出水解大米蛋白的最佳酶源為中性蛋白酶；通過響應面法分析優(yōu)化得到酶解大米蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：[S]5.0％、[E]/[S]2.3％、pH7.0、溫度37℃、時間4.2h，該條件下制備的大米蛋白抗氧化肽水解度(DH)為13.26％，對DPPH自由基(DPPH·)的清除率為60.54％。
　　 采用8種不同的體外抗氧化模型進一步測定了大米蛋白酶解產(chǎn)物(NHREPs)的抗氧化活性，探討了不同的DH對NHRE

3、Ps抗氧化活性的影響。結果表明，NHREPs的抗氧化活性與其水解度有關，DH為13％的NHREP是良好的電子供體和氫供體，能明顯抑制亞油酸體系的自動氧化過程；具有較強的羥基自由基(·OH)及DPPH·清除能力，而清除超氧陰離子(O2-*)能力稍弱；同時具有很強的Fe2+螯合能力。進一步測定不同水解度NHREPs的相對分子質(zhì)量分布情況，結果發(fā)現(xiàn)：水解度為13％時，在500～1,020Da范圍的肽段含量達54.73％。
　　 經(jīng)SP

4、-Sephadex C-25、SephadexG-15和半制備的RP-HPLC分離純化NHREP(DH=13％)，篩選出抗氧化活性較強的肽組分F3b和F3c。采用MALDI-TOF/TOF MS法測得F3b和F3c的相對分子質(zhì)量分別為959.5和1002.5。結合TOF-MS/MS和氨基酸分析儀得出：F3b的一級序列為Phe-Arg-Asp-Glu-His-Lys-Lys(簡稱為FRDEHKK)；F3c的一級序列結構為Lys-His-A

5、sn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe(KHNRGDEF)。
　　 采用固相合成法Fmoc法合成FRDEHKK，進一步驗證合成FRDEHKK的抗氧化活性試驗發(fā)現(xiàn)：FRDEHKK能夠抑制亞油酸體系的自動氧化過程，其抑制效果強于α-生育酚；不同劑量的FRDEHKK對自由基的清除能力強弱順序依次為：·OH＞DPPH·＞O2-(·)。FRDEHKK的還原能力呈現(xiàn)出較強的量效關系；FRDEHKK對Fe2+的螯合能力接近于EDTA。推