蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達載體構建及表達.pdf

1、廣州醫(yī)學院碩士學位論文蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達載體構建及表達姓名：鄧小亮申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：李冰20100601廣州醫(yī)學院碩士論文蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達載體構建及表達3材料與方法材料與方法1、pET1MT、pET2MT、pET3MT重組多拷貝重復表達MT原核載體的和基因工程菌的構建1)引物設計：由于要插入多個拷貝數的目的基因，因此在設計引物時，要考慮插入片段的順序問題，

2、既逐個片段插入。在設計第1對引物的時候，除在上游引物上添加一個內切酶位點外，于下游引物上添加2個了限制性內切酶位點，專為下一個片段的插入提供條件。類似的第2對引物的下游引物上也添加了特異性的限制性內切酶位點，專為第3個片段插入提供條件。在每條下游引物5’端添加一個特異性的蛋白切割位點，以滿足實驗或有的要求能將多串聯(lián)拷貝數的目標蛋白切割成單體。2)常規(guī)PCR：分別以3對引物和本中心原有的重組質粒GSTMT為模板，通過常規(guī)PCR獲得MT基因

3、的CDS片段3份，各份片段之間的區(qū)別僅在于片段兩端所帶的限制性內切酶位點不完全相同。按照插入順序的要求，分別標記為第1、2、3目的片段3)TA克?。簩CR擴增的3個片段分別與pMD19TSimpleVect做TA克隆，轉化大腸桿菌BL21，挑選陽性克隆，雙酶切、測序鑒定，結果顯示正確后將重組T載體依據所含的目的片段在預先設計時插入的順序，標記為T1、T2、T3。4)亞克隆：選用原核表達載體pET15b，建立融合6個His標簽的金屬硫蛋

4、白基因多串聯(lián)重復表達載體。用選定的第1組限制性內切酶特異性切割T1和原核表達載體pET15b，膠回收目的片段，將帶限制性內切酶粘性末端的第1目的片段通過T4DNA聯(lián)接酶聯(lián)接到原核表達載體pET15b上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，挑選陽性克隆雙酶切、測序鑒定，結果顯示完整地插入了目的基因片段后，標記為pET1MT。類似地以第2組限制性內切酶切割T2和pET1MT載體，膠回收目的片段，將帶限制性內切酶粘性末端的第2目的片段插