重組四價Aβ-,1-15-原核表達載體的優(yōu)化構(gòu)建和表達.pdf

1、老年性癡呆(Alzheimerdisease，AD)是以認知功能障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病。它的主要病理特征是腦內(nèi)細胞外老年斑沉積、細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失。關(guān)于AD的發(fā)病機制有多種假說，而其中的Aβ毒性學(xué)說是大多數(shù)人所認可的。 針對Aβ與AD的關(guān)系，人們提出了AD的免疫治療。1999年Schenk等人用Aβ42免疫治療AD轉(zhuǎn)基因動物模型，產(chǎn)生了特異性的抗Aβ42抗體，阻止和減少了淀粉樣斑塊的形成，而且提高接種

2、鼠的認知能力。隨后其他實驗室也證實Aβ42免疫的有效性。但是2002年以Aβ42為疫苗的臨床Ⅱ期實驗中，約6％病人出現(xiàn)了腦膜腦炎癥狀。分析認為，Aβ42肽C末端的T細胞表位激發(fā)了Th1反應(yīng)從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。因此在隨后的研究中，為了避免T細胞抗原表位激發(fā)的Th1反應(yīng)，研究者又提出用Aβ亞單位疫苗治療AD。 在實驗室的前期工作基礎(chǔ)上，本實驗優(yōu)化制備和純化了Aβ亞單位疫苗。在設(shè)計時為了避免細胞免疫反應(yīng)保證強的體液免疫反應(yīng)，去除了Aβ的

3、T細胞抗原表位保留了Aβ的B細胞抗原表位，并用多個重復(fù)B細胞抗原表位增加抗原的免疫原性；去除了目的基因前面的一段載體序列。選用更理想的純化標簽和載體來優(yōu)化構(gòu)建原核表達載體，使能更快速和簡便純化獲得目的蛋白。 材料與方法 1.原核表達載體pQE-4×Aβ1-15-O的優(yōu)化構(gòu)建及鑒定 根據(jù)人Aβ42的第1-15個氨基酸序列即Aβ1-15的氨基酸序列，選用大腸桿菌優(yōu)選密碼子，設(shè)計目的基因序列。目的基因序列用柔性肽連接四

4、個Aβ1-15組成，前面兩個Aβ1-15和后面兩個Aβ1-15都是由兩個甘氨基酸即Gly-Gly連接，中間的兩個Aβ1-15之間由甘氨酸和絲氨基酸即Gly-Ser-Ser-Gly連接。用兩對引物分別擴增前面兩個Aβ1-15和后面兩個Aβ1-15，獲得基因片斷。將兩個目的基因片段純化后分別克隆入pGEM-TEasy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌后挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)，基因測序及提取質(zhì)粒酶切鑒定得到重組質(zhì)粒。將從陽性重組質(zhì)粒中純化酶切出的目的基因片段

5、后面兩個Aβ1-15克隆入原核表達質(zhì)粒pQE-30a中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定得到陽性重組載體。之后純化酶切出目的基因片段前面兩個Aβ1-15，和用同樣的酶酶切純化的后面兩個Aβ1-15和質(zhì)粒pQE-30的陽性重組載體，在連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌EcoliDH5α挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定得到重組表達載體pQE-4×Aβ1-15-O。 2.重組表達載體pQE-4×Aβ1-is-O

6、的原核表達 制備E.coliM15感受態(tài)細胞，從E.coliDH5α菌中提取重組原核表達載體pQE-4×Aβ1-15-O，純化后轉(zhuǎn)化入E.coliM15中，優(yōu)化表達條件，用1mmol/L的IPTG濃度和在30℃條件下誘導(dǎo)表達，表達后超聲破碎裂解菌體，取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳及Western-Blotting鑒定。 3.目的蛋白的小量純化及鑒定 培養(yǎng)100ml細菌誘導(dǎo)表達，表達后超聲破碎裂解菌體，用hi

7、s-tagNi2+親和純化樹脂進行金屬親和層析純化獲得目的蛋白4×Aβ1-15，將目的蛋白用SDS-PAGE電泳觀察其純度，用Western-Blotting鑒定其免疫反應(yīng)性。 結(jié)果 1.構(gòu)建了原核表達載體pQE-4×Aβ1-15-OPCR擴增獲得目的基因片斷1-2×Aβ1-15和2-2×Aβ1-15，目的基因片斷T/A克隆后酶切和測序鑒定得到陽性重組載體pGEM-T-1-2×Aβ1-15和pGEM-T-2-2×Aβ1-

8、15。從pGEM-T-2-2×Aβ1-15酶切得到的2-2×Aβ1-15連接到pQE-30a上的到陽性重組載體pQE-30-2-2×Aβ1-15。酶切pGEM-T-1-2×Aβ1-15后獲得的1-2×Aβ1-15和用相同的酶酶切的pQE-30-2-2×Aβ1-15連接，獲得陽性重組載體pQE-4×Aβ1-15-O。 2.pQE-4×Aβ1-15-O表達目的蛋白 pQE-4×Aβ1-15-O在E.coliM15中誘導(dǎo)表達的

9、產(chǎn)物SDS-PAGE電泳顯示，目的蛋白主要呈可溶性表達，約占細菌總蛋白的15％。目的蛋白條帶在SDS-PAGE中顯示的相對分子質(zhì)量約為21KD，比理論計算的相對分子質(zhì)量9.1KD大。 3.純化獲得有免疫反應(yīng)性的目的蛋白pQE-4×Aβ1-15-O在E.coliM15中誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物用his-tagNi2+親和純化樹脂純化后，SDS-PAGE電泳顯示在21KD左右的單一目的條帶，證實純化后基本去除了雜蛋白。純化后的蛋白Wester

10、n-Blotting顯示21KD左右有單一條帶，表明表達的目的蛋白能和抗Aβ42的抗體特異性結(jié)合，具有免疫反應(yīng)性。 結(jié)論 1.利用基因工程的原理成功優(yōu)化構(gòu)建了重組pQE-4×Aβ1-15-O原核表達載體。 2.成功表達了帶his標簽的4×Aβ1-15蛋白，并優(yōu)化純化制備了四價串聯(lián)B細胞表位的4×Aβ1-15蛋白。 3.通過Western-blotting顯示，原核表達制備的4×Aβ1-15蛋白可和抗Aβ4