Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸脅迫下差異表達蛋白的研究.pdf

1、乳酸菌是一類非常重要的食品微生物,在食品中的應用可以追溯到數(shù)千年以前。它具有提高食品營養(yǎng)價值,改善食品風味,延長保存時間的功能,還具有多種有益于人類健康的活性。短乳桿菌是其中之一。近年來,短乳桿菌做為發(fā)酵劑、益生菌等被廣泛應用在食品工業(yè)生產中。但是由于自身產酸,在保存、食用過程中也會遇到外界酸性環(huán)境的影響,使得短乳桿菌不可避免的面臨酸脅迫。酸脅迫對短乳桿菌的存活、生長及生理活性有很大的影響。因此,為了生存、增殖并發(fā)揮其有益宿主健康的功能

2、,短乳桿菌必須具有應對酸脅迫的能力,并對酸脅迫產生應激反應來保護其生存、增殖。如果能夠找到提高乳酸菌耐酸能力的方法或途徑,將會極大地推動乳酸菌在食品工業(yè)生產中的應用。從理論意義上,對酸脅迫下乳酸菌的蛋白質組學的深入研究,不僅可以了解乳酸菌在酸應激反應中蛋白質的表達變化,而且可以了解生物在逆境中的某些相關基因和蛋白質的功能,進而分析揭示其酸應激反應的機制。
　　 Lactobacillus brevis NCL912是本實驗分離得

3、到的一株乳酸菌,具有高效轉化L-谷氨酸鈉成為γ-氨基丁酸的能力。本論文主要研究了以下內容。
　　 1.觀察了L.brevis NCL912在酸性環(huán)境下的生長及在pH2.0極端酸性環(huán)境中的耐酸性能。結果表明,L.brevis NCL912在pH3.5～6.4的酸性環(huán)境中可以生長,其最適生長pH是5.0。在pH2.0的極端酸性培養(yǎng)基中,該菌能夠存活4～6h。
　　 2.比較了添加與未添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevi

4、s NCL912的生長、存活、γ-氨基丁酸產量及谷氨酸脫羧酶活力,并對該菌的酸應激反應機制進行了分析。結果表明,添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912生長較好。在pH3.5～5.0條件下,L.brevis NCL912可以完全利用培養(yǎng)基中添加的L-谷氨酸鈉生成γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸的產量分別達10.77,11.44,10.94g／L。在兩種培養(yǎng)基中細菌的存活率和谷氨酸脫羧酶活力存在顯著性差異(p<0.05),添加

5、L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌耐酸性強,酶活力高。說明L-谷氨酸鈉對該菌在酸性環(huán)境中的生長、存活有重要的影響,其原因可能與γ-氨基丁酸的生成有關,即谷氨酸脫羧酶-γ-氨基丁酸逆向運輸系統(tǒng)可能是該菌的酸應激反應機制。
　　 3.乳酸菌的酸應激反應是一個涉及到多個基因和蛋白質的復雜的網絡調控體系。它不僅與依賴外部氨基酸的酸應激系統(tǒng)有關,而且菌體內部其他蛋白質也可能發(fā)生改變以應對酸脅迫。目前對短乳桿菌酸應激反應中菌體蛋白的差異表達及功能

6、分析報道較少。因此,從蛋白質組學水平,對L.brevis NCL912在酸脅迫下菌體蛋白質的變化進行了研究。
　　 本研究得到了均勻、背景清晰、分辨率高、重復性好的L.brevis NCL912的雙向凝膠電泳圖譜。對pH5.0和pH4.0條件下培養(yǎng)的該菌總蛋白質電泳圖譜進行比較,發(fā)現(xiàn)有25個差異表達蛋白,其中8個蛋白點得到了質譜鑒定。其中7個蛋白點表達上調,1個蛋白點表達下調。表達上調的7個蛋白點包括:酸應激蛋白2個,分別是通用

7、應激蛋白UspA蛋白和含CBS結構域蛋白；與蛋白質合成有關的蛋白3個,分別是50S核糖體蛋白L10,核糖體循環(huán)因子和SSU核糖體蛋白S30P；與代謝相關的蛋白是依賴NADP的3-磷酸甘油醛脫氫酶；與核苷酸合成有關的蛋白是次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。表達下調的蛋白是一個假設蛋白LVIS_0520,其功能未知。
　　 在酸脅迫條件下,L.brevis NCL912 CBS結構域蛋白基因的mRNA表達水平呈顯著上升(p<0.05),與蛋白質

8、圖譜上蛋白表達水平的變化一致,說明該菌蛋白質和mRNA表達水平之間有較好的相關性。
　　 4.應用蛋白質組學技術,對添加L-MSG培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912在酸脅迫條件下的差異蛋白表達也進行了探討。結果表明,在酸脅迫條件下,添加L-MSG培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912有26個蛋白發(fā)生了差異表達,其中11個蛋白得到了鑒定。這11個蛋白包括:通用應激蛋白UspA蛋白、熱應激蛋白GrpE、3-磷酸甘油醛脫氫

9、酶、核苷-二磷酸-糖差向異構酶、3-磷酸甘油酰基轉移酶PlsX、磷脂結合蛋白、S-核糖同型半胱氨酸酶、延伸因子Tu、RNA結合蛋白以及假設蛋白BRAFLDAFT_64486。轉錄學水平的驗證表明該菌蛋白質和mRNA表達水平之間有較好的相關性。
　　 5.對添加與未添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912已鑒定蛋白質的功能進行了分析比較,發(fā)現(xiàn)在酸脅迫條件下,無論是否添加底物氨基酸,L.brevis NCL912都