重組腺病毒心肌營養(yǎng)素-1轉染對神經(jīng)干細胞的作用.pdf

1、目的：觀察重組腺病毒心肌營養(yǎng)素-1（Adv-CT-1）轉染對神經(jīng)干細胞（NSCs）的保護作用及對定向分化為γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元的影響。
　　 方法：1.分離、培養(yǎng)及鑒定新生Wistar大鼠海馬NSCs，觀察不同傳代方法對NSCs的影響。2.Adv-CT-1及重組腺病毒增強型綠色熒光蛋（Adv-EGFP）轉染NSCs。將Adv-CT-1及Adv-EGFP分別以感染復數(shù)（MOI）為25、50、100、200 PFU/細胞

2、轉染NSCs，于轉染后24、48、72、96 h細胞免疫熒光染色檢測CT-1表達率，熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達。3.Adv-CT-1轉染對NSCs的保護作用。將NSCs隨機分為單純谷氨酸（Glu）組、CT-1干預組（Adv-CT-1轉染，MOI為200PFU/細胞）及正常對照組，其中單純Glu組和CT-1干預組暴露于50μmol/L的Glu培養(yǎng)液30 min，正常對照組不予處理。于12、24、48、72h采用四唑藍比色實驗（MTT）

3、了解細胞存活情況及原位缺口末端標記技術（TUNEL）檢測細胞凋亡。4.Adv-CT-1轉染對NSCs分化為GABA能神經(jīng)元的影響。將NSCs隨機分為Adv-CT-1轉染組（Adv-CT-1轉染，MOI為200 PFU/細胞）、血清組（培養(yǎng)基中添加10％的胎牛血清）及對照組（不予任何處理），于1、3、5、7d采用細胞免疫熒光染色檢測分化為GABA能神經(jīng)元比率。
　　 結果：1.新生大鼠海馬分離的神經(jīng)干細胞具有連續(xù)增殖能力，可表達巢

4、蛋白（Nestin），經(jīng)誘導可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。NSCs傳代時使用大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒較機械吹打法可以更好地保持NSCs的存活，減少NSCs死亡，有利于NSCs增殖。2.Adv-CT-1轉染NSCs后24、48、72、96 h CT-1表達率：MOI為25 PFU/細胞時分別為27.09％±4.25％、32.21％±4.96％、36.49％±2.31％及34.24％±4.02％；MOI為50 PFU/細胞時分別為37.73％

5、±3.50％、47.49％±2.87％、55.19％±4.54％及53.16％±4.87％；MOI為100 PFU/細胞時分別為54.82％±3.00％、67.19％±3.54％、75.10％±3.97％及72.81％±2.94％：MOI為200 PFU/細胞時分別為65.40％±3.74％、80.36％±4.35％、83.55％±3.07％及81.20％±3.13％。CT-1的表達率隨MOI的上升而升高，呈濃度依賴性。Adv-CT-1

6、以不同MOI轉染NSCs后CT-1的表達率均在72 h達高峰。Adv-EGFP轉染NSCs后24、48、72、96 h EGFP轉染率：MOI為25 PFU/細胞時分別為53.95％±5.19％、63.35％±2.43％、65.25％±2.29％及67.41％±4.16％；MOI為50 PFU/細胞時分別為63.80％±6.43％、72.03％±4.34％、75.52％±2.51％及77.52％±4.29％；MOI為100 PFU/細胞

7、時分別為71.50％+3.80％、84.96％±3.49％、86.71％±4.00％及88.05％±3.59％；MOI為200 PFU/細胞時分別為73.30％±2.50％、87.19％±3.50％、90.06％±2.87％及91.50％±3.40％。EGFP轉染率隨MOI的上升而升高，呈濃度依賴性。以不同MOI轉染NSCs后EGFP的轉染率均在96 h達高峰。3.暴露于Glu后12、24、48、72 h MTT吸光度（OD）值單純Gl

8、u組分別為0.317±0.035、0.262±0.034、0.332±0.050及0.386±0.030；CT-1干預組分別為0.375±0.033、0.323±0.031、0.412±0.027及0.480±0.055，24 h兩組OD值均降至最低。正常對照組12、24、48、72 h OD值分別為0.445±0.043、0.534±0.039、0.646±0.065及0.766±0.058。各時間點OD值正常對照組均高于單純Glu組

9、和CT-1干預組，CT-1干預組均高于單純Glu組，組間兩兩比較有顯著差異（P<0.05）。暴露于Glu后12、24、48、72 h細胞凋亡率單純Glu組分別為30.45％±5.91％、41.65％±4.35％、30.15％±2.96％及21.13％±3.91％；CT-1干預組分別為20.47％±2.30％、26.63％±3.31％、20.77％±2.61％及10.70％±3.30％，24 h兩組細胞凋亡率均升至最高。正常對照組12、2

10、4、48、72 h細胞凋亡率分別為2.48％±0.65％、2.94％±0.68％、2.80％±0.62％及3.08％±0.51％。各時間點細胞凋亡率正常對照組均低于CT-1干預組和單純Glu組，CT-1干預組均低于單純Glu組，組間兩兩比較有顯著差異（P<0.05）。4.于1、3、5、7 d NSCs分化為GABA能神經(jīng)元的比率：Adv-CT-1轉染組分別為8.49％±2.05％、22.65％±2.60％、36.70％±3.05％及46

11、.02％±5.77％；血清組分別為3.19％±0.79％、8.92％±1.58％、17.79％±3.33％及19.73％±3.83％：對照組分別為0.34％±0.27％、0.92％±0.55％、1.24％±0.45％及1.46％±0.52％。7 d時各組分化為GABA能神經(jīng)元的比率均升至最高，其中以Adv-CT-1轉染組為最高。各時間點NSCs分化為GABA能神經(jīng)元的比率Adv-CT-1轉染組高于血清組和對照組，血清組高于對照組，組間兩

12、兩比較有顯著差異（P<0.05）。7 d與14 d GABA能神經(jīng)元細胞數(shù)相比較，Adv-CT-1轉染組無顯著差異（t=2.445，P>0.05），血清組有明顯差異（t=5.96，P<0.01）。
　　 結論：1.從新生大鼠海馬中可成功分離培養(yǎng)出NSCs，利用大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒可以有效地進行傳代。2-Adv-CT-1和Adv-EGFP可以有效地轉染NSCs，并在NSCs中高效表達，同時EGFP熒光表達能間接反映CT-1的表達