抗人肺動脈內(nèi)皮細胞抗體在結締組織病伴肺動脈高壓中的研究.pdf

1、實驗目的:
　　肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）是一組以肺血管重建，血管腔狹窄、阻塞從而引起持續(xù)性肺動脈壓力升高的慢性疾病。根據(jù)2009年歐洲呼吸學會和歐洲心臟病學會聯(lián)合頒布的肺動脈高壓診治指南，最新診斷分類顯示多種因素可以導致PAH，其中最重要的疾病之一就是結締組織病(connective tissuedisease，CTD)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus ery

2、thematosus，SLE)、混合性結締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)、系統(tǒng)性硬化癥(systemicsclerosis，SSc)及類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)等。與特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathic PAH，IPAH)相比，CTD合并PAH的患者往往治療效果不佳，尤其SSc合并PAH的患者預后極差，2年生存率僅約為40％，成為臨床上CTD患者重

3、要的死亡原因之一。
　　CTD患者伴發(fā)PAH的發(fā)病機制目前仍不清楚。有研究顯示血管內(nèi)皮細胞(endothelial cell，EC)的異常改變往往是PAH疾病的最早期特點，如MCTD的患者在確切的PAH臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前，肺部就已出現(xiàn)微小的血管病理改變，如微動靜脈血栓形成及管壁增厚等，血管的損傷可能最終導致PAH的發(fā)生。
　　近年來，人們發(fā)現(xiàn)在風濕病患者的外周血中可檢測到一組能與血管內(nèi)皮細胞(endothelial cell，

4、EC)表面抗原相結合的抗體，即抗內(nèi)皮細胞抗體(anti-endothelialcell antibodies，AECA)，其可能通過多種機制與內(nèi)皮細胞相互作用，參與CTD發(fā)病過程，并發(fā)現(xiàn)AECA可能在CTD伴發(fā)PAH中發(fā)揮一定的作用。AECA的致病機制目前認為可能與AECA誘導EC活化及其釋放的細胞因子有關，這也可能是CTD伴發(fā)PAH的重要病理生理學機制之一。
　　關于AECA靶抗原特征目前仍不清楚。已報道的關于AECA的研究多采

5、用臍靜脈內(nèi)皮細胞，報道的AECA識別靶抗原的分子量約在15-200KD之間，不同CTD患者AECA可以識別的膜抗原成分亦不同?？紤]到不同的細胞表面的抗原表型可能存在一定的差異性，本文主要應用人肺動脈血管內(nèi)皮細胞(human pulmonaryartery endothelial cell，HPAEC)作為底物，分別采用不同方法檢測不同CTD伴或不伴PAH患者及部分健康對照人群血清中相應的抗HPAEC抗體，比較并分析該抗體與臨床的相關性，

6、分析該抗HPAEC抗體的體外相關作用，以期闡明抗HPAEC抗體在CTD伴PAH發(fā)生中的可能機制。
　　實驗方法:
　　一、應用間接免疫熒光法及細胞ELISA法檢測CTD伴或不伴PAH患者血清中抗HPAEC抗體，分析該抗體的臨床相關性
　　HPAEC購自Sciencell公司，應用血管內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(ECM)培養(yǎng)。以培養(yǎng)的HPAEC為底物，分別采用間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence

7、，IIF)以及細胞ELISA方法檢測不同CTD患者血清中的抗HPAEC抗體。所有41例CTD患者均為2009年2月至2011年2月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院門診及住院的病人。實驗組為CTD合并PAH組的患者，共19例，包括SLE8例，MCTD6例，SSc3例，pSS1例及uCTD1例。實驗對照組為CTD不伴PAH的患者，共22例，疾病組成與實驗組相匹配。另外選取20例健康對照組作為正常對照組。分析上述各組測得的抗HPAEC抗體與臨床相關特

8、征及實驗室資料的關系。
　　二、蛋白質免疫印跡法檢測血清特異性抗HPAEC抗體
　　將培養(yǎng)的HPAEC用胰蛋白酶/EDTA溶液自細胞培養(yǎng)瓶消化分離，PBS洗滌后經(jīng)細胞裂解液裂解提取HPAEC細胞抗原。細胞抗原蛋白裂解液煮沸后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜后準備與血清標本孵育。PVDF膜先用含5％脫脂奶粉的PBS封閉，然后用TTBS洗滌3次并切成小條，分別與不同分組的血清標本(1∶100稀釋)于聚乙烯透明袋

9、4℃孵育過夜。第二天充分洗膜后與稀釋的(1∶2000)堿磷酶標記的羊抗人IgG二抗室溫搖勻2小時。后再次用TTBS洗滌3次，之后加入底物搖床混勻顯色，蒸餾水清洗終止反應，掃描封存。
　　三、分離純化血清IgG抗HPAEC抗體
　　特異性抗HPAEC抗體陽性血清IgG應用Protein G純化分析試劑盒分離純化。血清用結合緩沖液1∶1稀釋，10000rpm離心20min。取上清上樣至Protein G親和分離柱中。樣品與Pro

10、tein G瓊脂糖凝膠充分作用后，用15ml結合緩沖液沖洗。結合的IgG用5ml洗脫緩沖液洗脫，沈脫液用500μl結合緩沖液中和。通過Bradford法測定IgG濃度。
　　四、抗HPAEC抗體作用后細胞培養(yǎng)上清中ICAM-1及RANTES的濃度測定
　　分離純化的特異性抗HPAEC抗體IgG加至HPAEC的培養(yǎng)液中，調(diào)整IgG的終濃度至1mg/dl。孵育48h后，收集培養(yǎng)上清。用ELISA試劑盒檢測上清中ICAM-1及RA

11、NTES含量。通過酶標儀于450nm波長讀取OD值，繪制標準曲線，計算ICAM-1及RANTES的含量。
　　五、流式細胞術測定抗HPAEC抗體誘導HPAEC凋亡
　　分離純化的特異性抗HPAEC抗體IgG加至HPAEC的培養(yǎng)液中，調(diào)整IgG的終濃度至1 mg/dl。分別孵育不同時間（12，24，48小時）后，用胰蛋白酶/EDTA溶液消化法收集細胞，應用AnnexinⅤ-FITC和PI雙染法經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

12、r>　　實驗結果:
　　1、以HPAEC為底物，IIF法檢測抗HPAEC抗體在41例CTD患者中的陽性者為17例(41.5％)。無論伴或不伴PAH，CTD患者的陽性率均明顯高于健康對照組（p＜0.05）。CTD伴PAH患者陽性率明顯高于(57.9％) CTD不伴有PAH患者(27.3％)，差異有顯著性?？笻PAEC抗體在伴有雷諾現(xiàn)象的CTD患者檢出率為62.5％，明顯高于無雷諾現(xiàn)象患者的檢出率(11.8％)，差異有統(tǒng)計學意義(p=

13、0.001)。
　　2、細胞ELISA法檢測抗HPAEC抗體在41例CTD患者的陽性率為51.2％。CTD伴或不伴PAH的患者其抗HPAEC抗體血清水平及陽性率兩方面均明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。CTD伴或不伴PAH患者細胞ELISA法檢測的抗HPAEC抗體的陽性率差異未見顯著性(p＞0.05);但CTD伴PAH患者抗體水平明顯高于不伴PAH者（0.797±0.312 versus0.480±0.175）

14、，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)?？笻PAEC抗體血清水平與CRP明顯相關（相關系數(shù)R=0.417，p＜0.05）。
　　3、以HPAEC細胞提取物為抗原，應用免疫印跡法檢測抗HPAEC結果顯示，41例CTD患者中共有28例患者血清中有針對不同條帶的抗HPAEC抗體。CTD伴PAH患者抗HPAEC抗體識別的條帶主要包括28KD，35 KD，53KD，75 KD和98KD。CTD不伴PAH患者識別的抗原條帶主要包括35KD，53

15、 KD，70KD和75KD等，健康對照組無特征性條帶發(fā)現(xiàn)。其中識別98KD-抗HPAEC抗體僅在CTD合并PAH患者組中出現(xiàn)(21.1％，4/19)。識別75KD的抗HPAEC抗體在CTD患者血清中檢出頻率最高（共14例陽性）。識別75KD和98KD的抗HPAEC抗體在CTD伴PAH患者陽性率明顯高于CTD不伴PAH患者(p＜0.05)。
　　4、抗75KD和98KD HPAEC抗體陽性血清純化IgG抗體以終濃度1mg/dl加入H

16、PAEC的培養(yǎng)上清中共同孵育，48小時后上清中RANTES的濃度為35.6±1.79pg/ml，而抗HPAEC抗體陰性者RANTES的平均濃度為13.8±0.28pg/ml，統(tǒng)計學分析檢測差異顯著(p＜0.05)。相同方法檢測48小時后上清中ICAM-1的濃度為795.2±32.5pg/ml，而抗HPAEC抗體陰性者ICAM-1的平均濃度為192.8±33.4pg/ml，統(tǒng)計學分析檢測差異顯著(p＜0.001)。
　　5、抗75K

17、D和98KD HPAEC抗體陽性血清純化IgG抗體以終濃度1mg/dl加入HPAEC的培養(yǎng)上清中共同孵育，結果顯示抗HPAEC抗體IgG作用不同時間后凋亡的細胞百分數(shù)為13.16±2.04％（12小時），23.62±3.22％（24小時），31.06±4.17％（48小時），而加入相同劑量的正常人IgG，不同時間后凋亡細胞數(shù)變化不明顯，差異有顯著性(p＜0.05)。
　　結論:
　　1、IIF法及細胞ELISA法均證實CTD

18、患者，尤其是CTD伴PAH患者血清中存在與HPAEC反應的抗HPAEC抗體。兩種方法均可用于檢測抗HPAEC抗體，在一定程度上可以互為補充。
　　2、抗HPAEC抗體與CTD的疾病活動指標CRP相關，可作為觀察疾病活動性的血清學指標之一并可用于監(jiān)測治療。
　　3、免疫印跡法證實抗HPAEC抗體是一組異質性抗體，可識別不同分子量的抗原成分。識別75KD和98KD的抗HPAEC抗體可能為CTD伴PAH患者的特異性抗體。