受體相互作用蛋白3在大鼠急性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)變化的初步研究.pdf

1、目的:研究受體相互作用蛋白3(Receptor Interacting Protein3，RIP3)在正常大鼠視網(wǎng)膜中的分布以及急性眼高壓早期大鼠視網(wǎng)膜RIP3表達(dá)的時(shí)空變化，初步探討急性高眼壓早期導(dǎo)致視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷的可能分子機(jī)制。
　　 方法:(1)隨機(jī)挑選6只健康的成年Sprague-Dawley大鼠，3只活取視網(wǎng)膜組織勻漿后進(jìn)行免疫蛋白印跡法檢驗(yàn)抗體特異性，3只灌注取材之后冰凍切片進(jìn)行抗體吸收實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)染色以及R

2、IP3與Neuron-specifc nuclear antigen(NeuN，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物)、Calbindin(CB，水平細(xì)胞標(biāo)志物)、Glial fibrillary acidic protein(GFAP,星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)、Glutamine synthetase(GS，Müller細(xì)胞標(biāo)志物)、Protein kinase C alpha(PKC-α，雙極細(xì)胞標(biāo)志物)、Parvalbumin(PV，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞標(biāo)志物)、

3、Rhodopsin(視細(xì)胞標(biāo)志物)、Synaptophysin(突觸標(biāo)志物)、Integrin，alpha M(CD11b，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色，分析RIP3在正常成年大鼠視網(wǎng)膜不同細(xì)胞類型中的表達(dá)分布;(2)挑選18只健康的成年Sprague-Dawley大鼠按照存活時(shí)間隨機(jī)分為6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)三個(gè)組，每組6只。一側(cè)眼球進(jìn)行加壓處理、另一側(cè)眼球作為自體對(duì)照，不作任何處理。高眼壓側(cè)眼球在眼前房插針加壓，維

4、持壓力至110毫米汞柱1小時(shí)，下架存活至相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)后，每個(gè)小組隨機(jī)取3只大鼠注射過(guò)量的麻藥后冰上快速剝離視網(wǎng)膜組織，免疫蛋白印跡法分析RIP3的表達(dá)量。每組另外3只大鼠灌注取材用免疫熒光染色分析RIP3在視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:1.RIP3在正常成年大鼠視網(wǎng)膜中的免疫組織化學(xué)染色顯示:神經(jīng)纖維層和節(jié)細(xì)胞層染色最強(qiáng)，內(nèi)核層染色強(qiáng)度較弱可見(jiàn)顆粒狀細(xì)胞形態(tài)，內(nèi)網(wǎng)層染色強(qiáng)度最弱，在外網(wǎng)層邊緣部分可見(jiàn)少量染色較淺的RIP3陽(yáng)

5、性細(xì)胞分布，外網(wǎng)層未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞染色，染色強(qiáng)度較弱;2.免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色顯示:在節(jié)細(xì)胞層，RIP3的陽(yáng)性產(chǎn)物與NeuN陽(yáng)性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo);在內(nèi)核層靠近內(nèi)網(wǎng)層邊緣部分與部分PV陽(yáng)性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo);在內(nèi)核層靠近外網(wǎng)層邊緣部分與部分CB陽(yáng)性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo)，此外，RIP3與PKC-α，GS陽(yáng)性產(chǎn)物，GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物以及CD11b陽(yáng)性產(chǎn)物呈現(xiàn)微弱的雙標(biāo);3.在急性高眼壓處理以后，Western blot顯示RIP3表達(dá)明顯增強(qiáng)，表

6、現(xiàn)為6小時(shí)、12小時(shí)的條帶明顯增粗，24小時(shí)條帶較12小時(shí)弱;免疫熒光染色顯示:急性高眼壓損傷后，損傷組與正常對(duì)照組相比RIP3陽(yáng)性染色分布未見(jiàn)明顯變化，節(jié)細(xì)胞層的RIP3陽(yáng)性染色明顯較對(duì)照組強(qiáng)，其中12小時(shí)染色最強(qiáng)，6小時(shí)和24小時(shí)的染色強(qiáng)度較空白對(duì)照組有所增強(qiáng)，但較12小時(shí)染色弱。
　　 結(jié)論:RIP3主要分布于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，并在部分無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和水平細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在其他類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞未見(jiàn)明顯表達(dá)。急性高眼壓早期