穩(wěn)定表達乙型腦炎病毒NS1蛋白細胞系的建立.pdf

1、流行性乙型腦炎(Japaneseencephalitis,JE)是由乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)引起的嚴重的人畜共患傳染病,JEV與西尼羅病毒(WestNilevirus,WNV)、圣路易腦炎病毒(Saint-Louisencephalitisvirus,SLEV)和墨累河谷腦炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus,MVEV)同屬一個血清群,其廣泛分布于東亞和南亞

2、。NS1蛋白作為一種膜功能相關(guān)糖蛋白,可能參與病毒的早期復(fù)制、RNA復(fù)制或病毒組裝和釋放,是主要的抗原成分之一。NS1蛋白不參與組成毒粒,因而沒有中和活性和血凝抑制活性,但它具有可溶性補體結(jié)合活性,可在不出現(xiàn)中和抗體的情況下誘生保護力,這種保護作用依賴于抗體的Fc片段。到目前為止,研究人員對NS1蛋白的作用機制尚不十分清楚,這就要求對其結(jié)構(gòu)、功能及特性進行深入的研究。然而,原核細胞表達的NS1蛋白不能形成原有的分子構(gòu)象,給研究帶來局限性

3、,因此需要建立能穩(wěn)定表達JEVNS1蛋白的真核細胞系。
　　 本研究將乙型腦炎病毒SA14-14-2株的NS1基因密碼子優(yōu)化后,進行人工合成。將NS1基因亞克隆至真核表達載體pCAGneo中并構(gòu)建重組質(zhì)粒,對其進行酶切鑒定和測序,該重組質(zhì)粒為陽性,命名為pCAGneo-opti-JEV-NS1。將該陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞,挑取單菌落并擴大培養(yǎng),在無菌條件下提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒線性化后調(diào)整至合適濃度,轉(zhuǎn)染RK-13細

4、胞,經(jīng)過G418加壓培養(yǎng),以有限稀釋法篩選出一株穩(wěn)定表達NS1蛋白的細胞系。該細胞系經(jīng)過RT-PCR、western-blot、IFA、免疫組化等方法鑒定,證實NS1蛋自在細胞內(nèi)可獲得穩(wěn)定表達。本研究為深入探討NS1蛋白作用機制提供了可能性,為研究JEV的致病機理和免疫機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 目前臨床上傳統(tǒng)的JE診斷方法有一定局限性,如用來檢測JEV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是建立在抗體和抗原相結(jié)合的基礎(chǔ)上,可能導(dǎo)致非