腫大細胞病毒敏感細胞系建立及病毒蛋白組和疫苗研究.pdf

1、腫大細胞病毒是造成廣泛的淡水和海水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性傳染病的重要病毒性病原。國內(nèi)最早于上世紀(jì)90年代初的養(yǎng)殖鱖暴發(fā)性流行病觀察到，并最終被確認為鱖暴發(fā)性流行病的病原。根據(jù)該病毒引起的發(fā)病鱖的臨床癥狀、病原及病理學(xué)特征定名為傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)。根據(jù)最新的國際病毒分類委員會第八次的分類報告(ICTV-8)，ISKNV被定義為虹彩病毒科(family Iridoviridae)新成立的腫大細胞病毒屬(genus Megalocyti

2、virus)的代表種。結(jié)合當(dāng)前腫大細胞病毒研究的難點和熱點，本文以鱖ISKNV為模式毒株，系統(tǒng)地研究了腫大細胞病毒的細胞培養(yǎng)體系并建立了高敏感細胞系。借助于該高敏感細胞系，我們首次分離到斑石鯛腫大細胞病毒(SKIV)并初步建立了鱖感染模型；進而對鱖ISKNV和斑石鯛SKIV進行了系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)解析；成功研制出對ISKNV和SKIV具有高效免疫預(yù)防作用的全細胞滅活疫苗。此外，還研制出抗ISKNV的單克隆抗體。本研究從整體上初步解決了長期

3、困擾我國的腫大細胞病毒的細胞培養(yǎng)問題、病毒的免疫預(yù)防問題和免疫診斷問題。同時，本研究還比較全面地揭示了病毒的主要編碼蛋白，填補了國際上對腫大細胞病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究的空白。這些研究成果還為進一步的有關(guān)腫大細胞病毒感染與致病機理方面的研究奠定了良好且必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容及取得的成果簡述如下： 1.鱖仔魚細胞系的建立及其對ISKNV的敏感性研究：本章報道建立一株鱖仔魚細胞系MFF-1。該細胞系自2006年4月傳代至今，兩年內(nèi)連續(xù)

4、傳代60余次，已經(jīng)發(fā)展為一株上皮樣細胞為主的連續(xù)細胞系。病毒感染試驗顯示，MFF-1對ISKNV高度敏感并通過免疫熒光、透射電鏡和RT-PCR得以驗證。流式細胞分析表明，用ISKNV特異性鼠抗ISKNV-VP23抗體作為標(biāo)記物，三天內(nèi)MFF-1對ISKNV的感染率達80.3％。電鏡觀察結(jié)果顯示，以連續(xù)傳代病毒感染MFF-1，感染細胞胞質(zhì)內(nèi)均可觀察到大量球狀病毒。利用ISKNV感染的MFF-1細胞上清回歸感染健康鱖可導(dǎo)致大量死亡，其癥狀與

5、自然暴發(fā)ISKNV病毒病癥狀類似。細胞凋亡試驗表明，ISKNV對MFF-1的感染可以引起部分感染細胞凋亡。此外，利用MFF-1敏感細胞系，我們首次純化到大量高純病毒，并給出了病毒結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白凝膠電泳圖譜。MFF-1是第一個來自于鱖的細胞系，同時也是第一個顯示對ISKNV高度敏感的魚類細胞系。 　　2.傳染性脾腎壞死病毒對鱖原代細胞的感染特性研究：尋求新的細胞敏感原：自一尾健康鱖分離并成功培養(yǎng)出4種原代細胞，通過細胞免疫熒光技術(shù)(IF

6、A)、透射電鏡觀察(TEM)、半定量PCR(RT-PCR)技術(shù)和Western-blot技術(shù)跟蹤了ISKNV在4種鱖原代細胞的復(fù)制、基因和蛋白的表達情況，最后證實鱖腦原代細胞(MB)和鰭條原代細胞(MF)對ISKNV高度敏感，ISKNV可引起MB和MF形成腫大細胞病毒所特有的細胞病理效應(yīng)(CPE)。性腺原代細胞(MG)和腎臟原代細胞(MK)則對ISKNV不敏感或低敏感。MB細胞已經(jīng)體外培養(yǎng)了近30代，有望建成繼MFF-1細胞之后的國內(nèi)第

7、二個腫大細胞病毒敏感細胞系，具有重要的應(yīng)用價值。 3.斑石鯛腫大細胞病毒(SKIV)的分離、鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及其對鱖的感染特性研究：利用MFF-1細胞系自湛江發(fā)病斑石鯛的脾臟分離到一株斑石鯛虹彩病毒，命名為SKIV-ZJ07。試驗表明，SKIV-ZJ07能夠在MFF-1上生長復(fù)制，可以引起典型的腫大細胞病毒細胞病變。透射電鏡分析顯示，SKIV-ZJ07感染的MFF-1細胞超薄切片可見大量晶格狀排列或散裝排列的球狀病毒。利用腫大

8、細胞病毒主衣殼蛋白(MCP)和ATP酶通用引物，克隆并測定了SKIV-ZJ07的MCP和ATPase基因序列全長；系統(tǒng)聚類分析顯示，SKIV-ZJ07與此前報道的斜帶石斑魚虹彩病毒(OSGIV)和日本新近分離的真鯛虹彩病毒U1株(RSIV-U1)高度同源，而與鱖ISKNV的遺傳距離較遠。推測SKIV-ZJ07可能代表了當(dāng)前我國海水養(yǎng)殖魚類腫大細胞病毒病的主要流行毒株。利用MFF-1培養(yǎng)的SKIV-ZJ07感染鱖，能導(dǎo)致感染鱖100％死亡

9、，并可觀察到典型的傳染性脾腎壞死病發(fā)病癥狀，電鏡照片顯示，發(fā)病鱖的頭腎和脾臟可見大量晶格狀排列病毒，上述結(jié)果顯示，鱖對SKIV高度敏感，可作為海水魚類腫大細胞病毒的淡水魚類感染模型。SKIV鱖感染模型的建立為海水魚類腫大細胞病毒疫苗的研究和應(yīng)用提供了便利。 4.ISKNV和SKIV的蛋白質(zhì)組學(xué)研究：利用差速離心結(jié)合二次蔗糖梯度離心技術(shù)分離純化到大量高純ISKNV和SKIV病毒粒子。利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI

10、／TOF MS)，對SDS-PAGE上的主要可見蛋白進行鑒定，結(jié)果ISKNV-NH0608有13個病毒蛋白得到可信鑒定，SKIV-ZJ07有23個病毒蛋白得到鑒定。進一步利用液質(zhì)聯(lián)用鳥槍法質(zhì)譜技術(shù)(Shotgun LC-MS)對ISKNV在SDS-PAGE上的病毒蛋白進行鑒定，結(jié)果ISKNV共有37個病毒蛋白得到可信鑒定。ISKNV和SKIV是首個進行蛋白組學(xué)分析的腫大細胞病毒，填補了腫大細胞病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究的空白，將進一步推動腫大細胞

11、病毒功能基因組學(xué)的研究。 5.ISKNV和SKIV疫苗的研究：利用原核表達技術(shù)成功表達鑒定了ISKNV-ORF006、ISKNV-ORF037、ISKNV-ORF115和ISKNV-ORF055等4個編碼蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析、免疫組化、免疫熒光和Western—blot分析結(jié)果可判斷這4個蛋白為ISKNV的結(jié)構(gòu)蛋白。利用上述純化的蛋白為免疫原免疫健康鱖。同時利用0.1％福爾馬林滅活I(lǐng)SKNV的MFF-1培養(yǎng)物為疫苗免疫鱖。免疫后3

12、0天，以107TCID50的病毒液腹腔注射攻毒，結(jié)果顯示，基因工程苗對免疫鱖都沒有明顯的免疫保護作用，而全細胞滅活苗免疫鱖的存活率為100％。此外，免疫30天收集的全細胞滅活苗的免疫鱖血清在1：50稀釋度內(nèi)對鱖的中和保護效果為100％。我們的結(jié)果表明，ISKNV全細胞滅活苗可誘導(dǎo)鱖產(chǎn)生高效保護作用，免疫保護期不低于3個月，其免疫保護機制可能以體液免疫應(yīng)答為主。此外，ISKNV免疫鱖也顯示對SKIV有很好的免疫預(yù)防效果。 6.IS

13、KNV單克隆抗體的制備及特性：利用雜交瘤細胞融合技術(shù)，通過細胞免疫熒光技術(shù)(IFA)和ELISA技術(shù)篩選到6株穩(wěn)定分泌抗ISKNV的雜交瘤細胞株，并制備出大量的小鼠腹水，通過一維(1-DE)和二維(2-DE)電泳western-blot分析表明，其中的5株單抗(1F6，1G2，386，3F11和488)主要針對約35 kDa和49 kDa的病毒蛋白，其中的一株單抗(2D8)針對分子量約20 kDa的ISKNV結(jié)構(gòu)蛋白，通過MALDI-T