天然免疫受體NOD2在成牙本質細胞中的表達及其功能研究.pdf

1、牙髓牙本質復合體受到外界刺激時激發(fā)免疫防御及修復反應以保存功能牙髓。成牙本質細胞是牙髓牙本質復合體的特征性細胞，位于牙髓牙本質交界處，是抵抗細菌和毒性產物在牙髓組織中擴散的第一道屏障，在牙髓損傷修復，尤其早期齲牙髓牙本質復合體防御修復反應中發(fā)揮重要作用。因此，成牙本質細胞的健康狀態(tài)反映了牙髓抵御外來有害刺激的潛能。近年研究發(fā)現成牙本質細胞除具有合成膠原和基質的基本功能外，還能產生多種炎癥介質和表達多種免疫受體，進而參與牙髓的天然和適應性

2、免疫防御反應。然而成牙本質細胞如何識別外來抗原以進行免疫防御的機制尚不清楚。最新研究發(fā)現NODs蛋白是胞漿型PRR中的一個重要家族，與膜型PRR TLRs相似，識別并結合病原微生物的PAMPs，啟動機體的天然免疫應答。其中NOD2是研究較多的受體之一，它能與幾乎所有細菌(尤其G+菌)的PGNs最小免疫活性分子MDP結合，進而啟動天然免疫，并成為聯系適應性免疫的紐帶。本課題組前期研究已證實，正常人牙髓組織組成性表達NOD2蛋白，主要分布于

3、成牙本質細胞層及血管內皮細胞，推測牙髓組織通過天然免疫受體NOD2識別病原微生物，啟動牙髓天然免疫。那么，天然的成牙本質細胞是否功能性表達NOD2，及其下游的效應如何，尚未清楚。本研究擬通過檢測天然成牙本質細胞中NOD2的表達情況，建立成牙本質樣細胞體外模型，觀察NOD2受體激活劑MDP刺激成牙本質樣細胞后NOD2受體表達的變化，及其引發(fā)的下游反應，以探討NOD2在成牙本質細胞發(fā)揮免疫防御功能中所起的作用。
　　 目的：本研究通

4、過檢測天然免疫受體NOD2在成牙本質細胞中的表達及其引發(fā)的下游效應，探討NOD2受體在牙髓組織天然免疫中發(fā)揮的作用，了解牙髓牙本質復合體在早期齲的免疫防御機制。
　　 方法：①收集因阻生需要拔除的年輕健康完整第三恒磨牙，分離冠根，摘除牙髓后刮取成牙本質細胞層，real-time PCR及Western blot分別檢測天然的成牙本質細胞中NOD2 mRNA及蛋白的表達。②建立成牙本質樣細胞體外模型，并通過成牙本質細胞生物學特性鑒

5、定培養(yǎng)所獲細胞：倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察；免疫熒光和real-time PCR分別檢測細胞內成牙本質細胞標記分子DSP蛋白及DSPP、DMP-1mRNA表達情況;ALP活性檢測及Von Kossa染色檢測細胞礦化能力。③利用MDP刺激成牙本質樣細胞，不同時間點收集樣本，real-time PCR及Western blot檢測刺激前后NOD2表達情況；ELISA檢測刺激前后細胞分泌hBD-2及IL-6情況；real-time PCR檢測

6、刺激前后細胞內DSPP mRNA表達情況。
　　 結果：⑴本研究通過real-time PCR及Western blot檢測，結果均顯示天然的成牙本質細胞組成性表達NOD2。⑵成功建立成牙本質樣細胞體外模型，顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)所獲細胞主要呈多角形，核偏極，部分細胞可見伸長的胞漿突起;免疫熒光顯示細胞內DSP蛋白表達陽性；real-time PCR檢測到細胞表達DSPP、DMP-1mRNA，且與天然成牙本質細胞表達量差異無統計學

7、意義；ALP活性檢測顯示培養(yǎng)所獲細胞較牙髓細胞具有較高的ALP活性，Von Kossa染色可見較多礦化結節(jié)的形成，表明其有較強的礦化能力。⑶利用MDP刺激成牙本質樣細胞后，real-timePCR及Western blot檢測結果顯示細胞內NOD2表達上調，ELISA檢測到刺激后早期細胞分泌較多的hBD-2，并在24h內隨著時間的延長呈逐漸增高的趨勢，而IL-6產生量較少，且real-time PCR檢測顯示細胞內DSPP mRNA表達