TLR9信號途徑在成牙本質細胞中作用的研究.pdf

1、齲病是口腔常見病、多發(fā)病。當齲壞到達牙本質后，致齲菌和/或其毒性產物可以通過牙本質小管進入牙髓腔，導致牙髓炎癥。免疫反應和第三期牙本質是牙髓發(fā)揮防御和修復能力的主要方式。成牙本質細胞由于具有長的細胞突起深入到牙本質小管，是牙髓牙本質復合體最先接觸細菌微生物的細胞，那么成牙本質細胞是否和口腔粘膜上皮細胞一樣，具有天然免疫的功能，多年來未見研究報道。TLR9是特異識別包含未甲基化CpG基序的細菌DNA（CpGDNA）的天然免疫受體，在許多組

2、織細胞均可快速激活天然免疫反應，并啟動后續(xù)的適應性免疫反應，在組織細胞免疫防御反應中發(fā)揮重要的作用，目前在抗感染、抗過敏和抗腫瘤治療中已取得了很大的研究進展。本課題組發(fā)現體外培養(yǎng)的成牙本質細胞樣細胞表達TLR9，提示TLR9可能介導成牙本質細胞的天然免疫功能。但是對于體內的成牙本質細胞是否表達TLR9、TLR9是否特異識別細菌DNA、TLR9活化后細胞內信號途徑以及下游基因表達情況國內外尚未見報道。
　　面對細菌入侵，除了免疫反應

3、，形成第三期牙本質是牙髓發(fā)揮防御和修復能力的另一種主要方式。許多研究證實DSPP基因表達產物在牙本質形成和礦化，以及第三期牙本質形成過程中均發(fā)揮著關鍵性的作用。由于在細菌感染導致成牙本質細胞或成牙本質細胞樣細胞形成第三期牙本質的過程中伴隨DSPP基因表達，那么成牙本質細胞內TLR9信號途徑在被細菌DNA活化后是否調控DSPP基因表達國內外尚未見研究報道。
　　綜上所述本實驗通過分子生物學實驗方法對TLR9、DSPP基因進行研究，旨

4、在闡明TLR9介導成牙本質細胞天然免疫反應和調控DSPP基因表達的細胞內信號途徑。探討齲病進展過程中，細菌DNA感染、成牙本質細胞免疫反應、DSPP基因表達與第三期牙本質形成相互之間的聯系，對闡明牙髓病病因、牙髓損傷修復的分子機制和DSPP基因表達調控規(guī)律有重要意義，為免疫防齲研究和活髓保存治療提供新的思路和途徑。
　　1TLR9、DSPP在成牙本質細胞和牙髓組織中的表達
　　首先收集小鼠牙髓組織利用組織塊抽提RNA方法提取

5、總RNA，反轉錄，行PCR擴增觀察TLR9mRNA在牙髓組織中的表達；其次從小鼠OLC成牙本質細胞系中提取總RNA，反轉錄，行PCR擴增觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達。1％瓊脂糖凝膠電泳顯TLR9mRNA在小鼠牙髓組織中和OLC細胞系中均有顯著表達，DSPPmRNA在OLC細胞系中有顯著表達。TLR9mRNA分子量198bp，DSPPmRNA分子量151bp。
　　2CpGDNA對OLC細胞內TLR9、DSPP基因表

6、達調控
　　6孔板培養(yǎng)OLC細胞，用CpGODN-A和CpGODN-B刺激細胞，設置時間梯度為0、3、6、9、12、24小時。提取總RNA，反轉錄，行PCR擴增和實時定量PCR以觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達量變化。1％瓊脂糖凝膠電泳結果和實時定量PCR結果顯示CpGODN-A刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達量無明顯變化。CpGODN-B刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達量呈現先升高后降低的

7、變化，6小時表達量最高，且6小時組是0小時組的3倍。
　　3參與CpGOND調控DSPP基因的表達的細胞內信號途徑
　　三種細胞信號途徑抑制劑：ERK信號途徑抑制劑，PD98059；p38信號途徑抑制劑，SB203580；NF-κB信號途徑抑制劑，PDTC。OLC細胞經以上三種抑制劑（濃度為30μmol/L）作用后，加入CpGODN-B刺激6小時后提取總RNA，實時定量PCR結果顯示ERK和NF-κB組DSPPmRNA表達明